不同物种ANGPTL4基因及其蛋白理化性质和分子结构的生物信息学分析

吕文涛，杨 华，杨彩梅，李 娜,，郑自彬，王远霞，王兴鑫,，肖英平*

（1.省部共建国家农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，浙江杭州 310000；2.浙江农林大学动物科技学院，浙江杭州 311300）

血管生成素样蛋白4（Angiopoietin-Like Protein 4，），也称为禁食诱导脂肪因子（Fasting Induced Adipose Factor，），是一类与血管生成素（Angiopoietin，）结构类似的分泌性蛋白家族成员。ANGPTL4具有N端的卷曲-螺旋结构域和C端的纤维蛋白原样结构域，主要参与脂肪代谢、糖代谢、血管生成、炎症反应及胰岛素敏感性等生理状况的调节，尤其对脂肪代谢有着重要的调控作用，同时已有研究证实还在调控肿瘤发生、发展和诊疗中起重要作用。Nielsen等研究发现ANGPTL4蛋白参与脂质代谢，通过抑制活性起作用，会导致血浆甘油三酯（Triglyceride，TG）衍生的脂肪酸释放减少。Altun等已确定肝脂肪变性患者血清表达水平较低，通过游离脂肪酸代谢和过氧化物酶体增殖物激活受体-（）的诱导，在脂肪肝疾病发病机制中起重要作用。Aronsson等研究表明，在动物机体内受肠道菌群调控，肠杆菌增加会抑制的表达，使得表达不受抑制而导致脂质沉积。的功能研究主要集中在人类和小鼠2个物种上，猪和牛的分别于2006年和2014年发现并开始研究其功能。在不同物种中的功能类似，通过抑制活性和提高脂肪细胞中甘油三酯的分解，从而降低机体脂肪组织的重量。然而，几种主要动物的ANGPTL4蛋白生物信息学分析对比尚未有人研究。本文通过分析ANGPTL4的分子结构和理化性质，从生物信息学角度揭示ANGPTL4的功能和作用，为探究不同物种ANGPTL4蛋白的生物学功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 不同物种基因序列的获取 利用NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得人、鼠、马、猫、牛、羊、猪、鸡、鸭、粉脚雁和黄颡鱼的基因和蛋白质编码登录号，如表1所示。

表1 11个物种的ANGPTL4基因和蛋白登录号

1.2 构建ANGPTL4蛋白的系统进化树 利用Ensembl（http://www.ensembl.org/index.html）数据库信息，选取11种物种相应的源基因，然后使用BioEdit（Verision8）软件对上述不同物种基因蛋白序列进行比对分析，采用Poisson model模型及MEGA7.0 Neighbor-Joining方法构建物种间系统进化树。

1.3 不同物种ANGPTL4基本理化性质分析 采用各种在线分析网站对猪、鸡、鸭、粉脚雁和黄颡鱼ANGPTL4的信号肽区域、易于被特定蛋白酶磷酸化的位点、糖基化位点、跨膜区及可能的螺旋卷曲结构进行了分析，并将猪、鸡、鸭、粉脚雁和黄颡鱼的ANGPTL4蛋白进行比较。各理化性质分析及在线分析网站如表2所示。

表2 不同物种的ANGPTL4基本理化性质分析

2 结果与分析

2.1基因的序列相似性与系统进化分析

2.1.1 不同物种编码区序列相似性比对 如表3所示，反刍动物牛和羊之间编码区序列的相似性最高，达到97.60%；其次是鸭和粉脚雁，序列相似性达到97.50%；人与黄颡鱼的序列相似性最低，为49.50%。由表3可以看出，反刍动物及禽类在物种之间序列相似性很高，而其余物种之间的序列相似性不高（51.00%～62.60%）。

表3 不同物种编码区（CDS）序列比例 %

2.1.2 不同物种ANGPTL4蛋白进化树 如图1所示，鸭与粉脚雁、鸡的亲缘关系最近，与黄颡鱼的亲缘关系最远；哺乳类动物中，鸭与鼠的亲缘关系最远。鸭和粉脚雁的关系最近，表明在禽类中遗传和表达差异最小，其次与鸡的关系最近，表明在家禽中的表达差异较小。

图1 不同物种ANGPTL 4蛋白的进化树

2.2的基本理化性质分析 如表4所示，猪、鸡、鸭、粉脚雁和黄颡鱼的亲水性均为负值，预测结果表明ANGPTL4蛋白为亲水性蛋白。鸭的不稳定系数小于40，分析结果表明鸭ANGPTL4蛋白为稳定性蛋白；而猪、鸡、粉脚雁和黄颡鱼的不稳定系数均大于40，表明该4个物种的ANGPTL4蛋白为不稳定性蛋白。如图2所示，这几种物种的氨基酸组成中都含有20种常见的氨基酸，亮氨酸（Leu）含量最高，半胱氨酸（Cys）含量最低；此外，3种禽类：鸡（）、鸭（）和粉脚雁（）的ANGPTL4的氨基酸含量差别不大，而猪（）和黄颡鱼（）与3种禽类的ANGPTL4中多数氨基酸含量差异比较大。

图2 不同物种ANGPTL4氨基酸含量比

表4 不同物种ANGPTL4的基本理化性质分析结果

2.3 ANGPTL4的亲水/疏水性分析 如图3所示，在1～20位之间5个物种氨基酸序列都极具疏水性。猪ANGPTL4疏水性最强的位点在第13位的亮氨酸、第14位的半胱氨酸，分值为2.311；亲水性最强位点是第378位的谷氨酸，分值为-3.711。鸡ANGPTL4疏水性最强的位点在第10位的亮氨酸、第11位的半胱氨酸，分值为2.544；亲水性最强位点是第444位的组氨酸，分值为-3.633。鸭ANGPTL4疏水性最强的位点在第10位的亮氨酸、第11位的半胱氨酸、第12位的丙氨酸，分值为2.589；亲水性最强位点是第448位的组氨酸，分值为-3.633。粉脚雁ANGPTL4疏水性最强的位点在第10位的亮氨酸、第11位的半胱氨酸、第12位的丙氨酸，分值为2.589；亲水性最强位点是第450位的组氨酸，分值为-3.633。黄颡鱼ANGPTL4疏水性最强的位点在第12位的苏氨酸，分值为2.733；亲水性最强位点是第368位的天冬氨酸，分值为-3.844。整体来看，ANGPTL4蛋白亲水性氨基酸的数量远多于疏水性氨基酸的数量，表明ANGPTL4为亲水性蛋白，与理化性质分析结果一致。

图3 不同物种ANGPTL4亲水/疏水曲线

2.4 ANGPTL4的信号肽分析 如图4可知，不同物种在第18～26位氨基酸之间存在裂解位点；猪、鸡、鸭、粉脚雁和黄颡鱼氨基酸序列的裂解位点分别在25～26、18～19、19～20、20～21、20～21位；因此ANGPTL4蛋白存在信号肽结构。且利用TMHMM 2.0分析发现，猪、鸡、鸭、粉脚雁和黄颡鱼的基因编码残基的所有氨基酸都不存在跨膜区域。

图4 不同物种ANGPTL4信号肽分析

2.5 ANGPTL4的磷酸化位点 如图5所示，猪ANGPTL4编码蛋白有23个潜在磷酸位点，其中包括有15个Ser、7个Thr和1个Tyr磷酸化位点；鸡ANGPTL4编码蛋白有37个潜在磷酸位点，其中包括有25个Ser、10个Thr和2个Tyr磷酸化位点；鸭ANGPTL4编码蛋白有40个潜在磷酸化位点，其中包括有27个Ser、10个Thr和3个Tyr磷酸化位点；粉脚雁ANGPTL4编码蛋白有34个潜在磷酸位点，其中包括有23个Ser、9个Thr和2个Tyr磷酸化位点；黄颡鱼ANGPTL4编码蛋白有43个潜在磷酸位点，其中包括有28个Ser、13个Thr和2个Tyr磷酸化位点。同时从图6可以看出，ANGPTL4蛋白质序列中有易被特定蛋白酶磷酸化的位点，结果显示：猪在S74位含有1种嗜碱性丝氨酸-苏氨酸激酶（Baso-ST-kin）、在V281位有1种激酶结合位点群（Kin-bind）、在W389位有1种脂酶结合位点群（lip-bind）；鸡在S85位和S238位各有1种嗜碱性丝氨酸-苏氨酸激酶群（Baso-ST-kin）、在W455位有1种脂酶结合位点群（lip-bind）；鸭在S91位含有1种嗜碱性丝氨酸-苏氨酸激酶（Baso-ST-kin）、在W459位有1种脂酶结合位点群（lip-bind）；粉脚雁在S91位含有1种嗜碱性丝氨酸-苏氨酸激酶（Baso-ST-kin）、在W461位有1种脂酶结合位点群（lip-bind）；黄颡鱼在W418位有1种脂酶结合位点群（lip-bind）。

图5 不同物种ANGPTL4序列中磷酸化位点

图6 不同物种ANGPTL4序列中易于被特定蛋白酶磷酸化位点

2.6 ANGPTL4的糖基化分析 分析发现，猪只有1个典型N糖基化位点，位于183位；鸡有5个典型的N糖基化位点，分别位于88、124、165、224、247位；鸭ANGPTL4有5个典型的N糖基化位点，分别位于第94、130、171、230、249位；粉脚雁ANGPTL4有6个典型的N糖基化位点，分别位于第94、130、171、230、249、253位；黄颡鱼有5个典型的N糖基化位点79、115、151、205、335。

2.7基因编码蛋白的卷曲螺旋分析 分析发现，不同物种的卷曲螺旋数量存在差异，但在50～250位氨基酸序列，大部分物种存在至少一个卷曲螺旋结构。

2.8 不同物种ANGPTL4二级结构预测及三级结构同源建模 如图7所示，猪ANGPTL4蛋白由412个氨基酸组成，包含12个螺旋和8个折叠；鸡ANGPTL4蛋白由478个氨基酸组成，包含17个螺旋和6个折叠；鸭ANGPTL4蛋白由482个氨基酸组成，17个螺旋和6个折叠；粉脚雁ANGPTL4蛋白由480个氨基酸组成，19个螺旋和6个折叠；黄颡鱼ANGPTL4蛋白由436个氨基酸组成，包含14个螺旋和11个折叠。

图7 不同物种ANGPTL4二级结构预测

ANGPTL4蛋白的三级结构预测如图8所示。猪蛋白结构C值为-0.5，目标蛋白和模板蛋白结构相似性的TM值为0.65±0.13；鸡蛋白结构C值为-1.48，目标蛋白和模板蛋白结构相似性的TM值为0.53±0.15；鸭ANGPTL4预测结果的蛋白结构C值为-1.91，目标蛋白和模板蛋白结构相似性的TM值为0.49±0.15；黄颡鱼蛋白结构C值为-1.79，目标蛋白和模板蛋白的结构相似性的TM值为0.50±0.15。

图8 不同物种ANGPTL4蛋白三级结构预测

3 讨 论

ANGPTL4蛋白在机体的多个组织中都有表达，结构类似于血管生成素，但功能有所不同；mRNA在白色脂肪和肝脏中表达较多。Kim等利用ANG同源基因的PCR扩增寻找ANG的同源蛋白时发现了ANGPTL4蛋白家族；Kersten等在肝细胞中发现了新的靶基因——，又称为。2002年，国际人类基因组织将该基因命名。

本文通过生物信息软件对不同物种ANGPTL4蛋白的理化性质、生物学功能、系统进化关系、蛋白二级/三级结构等进行了分析及预测。分析表明，家禽之间亲缘关系最近，鸭与粉脚雁序列相关性高达94.4%、鸭与鸡的高达88.20%。结构决定功能，因此可以推测，鸭的功能与粉脚雁和鸡的功能类似，促进脂代谢并抑制LPL活性，进而引起高血脂。蛋白一级结构中的半胱氨酸多形成二硫键以增强蛋白质结构的稳定性，而亮氨酸含有疏水侧链，疏水作用是蛋白质折叠的主要驱动力，因此亮氨酸等疏水氨基酸常作为水溶性蛋白质的内部支撑结构。氨基酸组成分析发现，亮氨酸含量最高，半胱氨酸含量最低，可以推测ANGPTL4蛋白质结构稳定性低且水溶性较好，与理化性质分析结果一致。分析结果表明ANGPTL4为细胞外的可溶性蛋白。整体来看，ANGPTL4蛋白亲水性氨基酸的数量远多于疏水性氨基酸的数量，表明ANGPTL4为亲水性蛋白，与理化性质分析结果一致。

信号肽作为蛋白质的一个片段，是蛋白质合成并释放到胞外不可或缺的一部分。信号肽分析发现，ANGPTL4在N端前有一段信号肽，结合各物种ANGPTL4亲水/疏水性分析比较显示1～20位氨基酸极具疏水性，表明ANGPTL4前端信号肽序列极具疏水性。此外，分析表明ANGPTL4不存在跨膜结构，推测ANGPTL4可能不通过跨膜发挥生物学作用，而在胞外或者固定在细胞膜表面发挥其生物学功能，这与已知的猪和鸡的功能一致。

蛋白质的磷酸化是由蛋白质激酶（Kinase）催化的磷酸基团转移反应，是最常见、最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一，在细胞信号转导过程中起重要作用，磷酸化主要发生在蛋白质的丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）等残基上。磷酸化反应后，由于蛋白质加入了磷酸基团，蛋白质的构型、活性及其与其他分子相互作用的性能发生了改变。本研究的分析结果表明，ANGPTL4有多个潜在磷酸化位点，初步揭示ANGPTL4蛋白的这些位点可能是调控活性的靶点。Costa等研究中指出在脊椎动物发育中对脂质和TG代谢起重要作用。是乳糜微粒、极低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein，VLDL）等代谢关键因子，将血液中乳糜微粒和VLDL中的TG催化水解为甘油和脂肪酸，在血脂代谢和转运中发挥着重要作用。从分析结果来看，不同物种ANGPTL4磷酸化位点的预测中发现激酶和脂蛋白脂酶结合位点群，揭示ANGPTL4蛋白参与机体脂质代谢过程。

蛋白糖基化也是一种蛋白质翻译后修饰，是由糖基转移酶催化的单糖与蛋白质上的某些残基形成共价连接。糖基化通常使蛋白质在水中的溶解度增大，并使不同的蛋白质打上不同的标记，改变多肽的构象并增加蛋白质的稳定性。本研究中预测到了不同物种ANGPTL4蛋白的多个糖基化修饰位点，且氨基酸功能位点集中在45～250位范围内，预测该区段内的氨基酸对不同物种ANGPTL4蛋白发挥其生物学功能有重要意义。糖基化有能够使蛋白质抵抗消化酶、赋予蛋白质传导信号以及辅助蛋白在糖基化以后正确折叠等多种作用，具有重要的生物学意义。此外，在45～250位氨基酸残基范围内，多数物种都存在至少1个卷曲螺旋结构和至少1个磷酸化位点，可以推测的这个螺旋结构是其与其他分子相互作用的靶点。

4 结 论

本研究利用多种生物信息学软件分析了猪、鸡、鸭、粉脚雁和黄颡鱼等几种不同物种ANGPTL4蛋白的氨基酸组成特点、理化性质和分子结构。研究发现：ANGPTL4蛋白的氨基酸组成在禽类与哺乳动物和水产之间有一定的差别；对各物种ANGPTL4蛋白的疏水性、磷酸化位点、糖基化位点以及卷曲螺旋结构的预测结果表明，在45～250位氨基酸区域具有特定的理化性质和分子结构，推测该序列可作为调控功能的靶位点。该研究将为进一步研究的特殊功能性及其与其他分子相互作用的机制提供了生物信息学参考。