性早熟与性晚熟的清远麻公鸡的生长发育比较研究

邓智丹，肖 俊，李 华,*，向 海，于 辉,，韦金兑，束靖婷

（1.佛山科学技术学院，广东省动物分子设计与精准育种重点实验室，广东佛山 528225；2.广东天农食品集团有限公司，广东清远 511827；3.中国农业科学院家禽研究所，江苏扬州 225125)

公鸡的早熟性和晚熟性主要以羽毛成熟性以及体成熟等进行评估。性早熟主要通过鸣叫和鸡冠性状来判别，体成熟与体重相关。本研究对种公鸡进行了早熟性及晚熟性的品种比较选育，以求得到最大体重及最佳肉质的上市日龄，增加经济价值。鸡冠作为鸡重要的第二性征，其发育程度与性腺发育有密切联系，在接近性成熟时，体重与鸡冠和性腺发育显著相关。目前，生长曲线的拟合主要集中在体重增长规律方面，对于体重与局部生长的鸡冠和睾丸生长发育的关联分析较少。因此，本研究应用Logistic、Gompertz和Bertalanffy 3种曲线模型拟合清远麻公鸡的体重和鸡冠生长发育规律，比较分析公鸡H组和L组的体重及鸡冠生长发育模式的差异，找到影响早熟和晚熟群体体重和鸡冠的生长拐点及两者间的关联，并通过组织学观察和实时荧光定量PCR（qRT-RCR）技术探讨鸡冠和睾丸发育的相关性。前人研究表明，Ly1抗体反应基因（）、热休克蛋白家族A成员4样基因（）、神经外营养蛋白2基因（）和内咖肽A3基因（）与雄性哺乳动物中的生殖细胞或睾丸发育有关，其是否与高矮冠组的公鸡性腺发育有关，尚值得进一步研究。本研究旨在探讨早熟和晚熟公鸡性成熟前发育规律，为进一步深入解析性早熟和性成熟的遗传机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验鸡群为广东天农食品集团股份有限公司提供的清远麻快羽（K系）公鸡95只，在7周龄分为高冠组（42只，冠高介于22～29 mm为H组）和矮冠组（53只，冠高介于10～17 mm为L组），H组的冠高比L组高9.97 mm。实验种公鸡饲养和免疫条件与企业种公鸡饲养和免疫条件相同。光照条件明期（Light）和暗期（Dark）时长比值为1 L:1 D；饲料营养水平：代谢能为10.71 MJ/kg，粗蛋白13.00%，钙1.10%，总磷0.59%。

1.2 指标测定方法 在7～20周龄，每周测定实验鸡群的鸡冠高度和体重，测定参照《NY/T 823.2004家禽生产性能名词术语和度量统计方法》执行。

1.3 组织学分析 11周龄时分别对H组和L组公鸡各解剖30只，称睾丸重量，采集睾丸在4%多聚甲醛溶液中固定10 d。标本经石蜡包埋切片处理，采用苏木精-伊红染色方法染色，制片后在光学显微镜100×倍数下进行观察。

1.4 统计方法与拟合曲线模型 应用Excel 2016、SPSS 20.0和Prism 8.0.1对清远麻公鸡体重和冠高进行Logistic、Gompertz和Bertalanffy 3种模型的相关计算和图形拟合。

1.5 引物设计与合成 参照qRT-PCR SYBR Green I法引物设计要求，根据GenBank中鸡的、基因序列，用软件Primer Express 3.0设计引物，并交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息见表1。

表1 基因引物序列信息

1.6 反转录PCR 以RNA为模板，进行反转录，反应体系：5×RTase Reaction Buffer Mix II 2 μL，Evo M-MLV RTase Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer（50 μM）0.5 μL，Random 6 mers Primer（100 μM）0.5 μL，Total RNA 0.5 μL，RNase free water 6 μL。反应条件：37℃ 15 min；85℃5 s，4℃保持至程序结束，共1个循环。

1.7 实时荧光定量PCR 以反转录的cDNA为模板，采用SYBR Green Ⅰ法进行荧光实时定量PCR反应，以基因作为内参基因进行数据的标准化处理，反应体系：2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μM），cDNA模板1 μL，加ddHO补足至20 μL。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40个循环，扩增后经融解曲线检测特异性。每次反应均设空白样品为阴性对照，每个样品设置3个重复。基因相对表达量采用2法计算。

2 结果与分析

2.1 清远麻公鸡体重生长曲线及拟合分析 在7～20周龄，整个生长阶段H组和L组的累计生长曲线表明了体重增长规律的一致性（图1a），H组和L组体重生长变化在绝对生长曲线上发现4个生长低峰和3个生长高峰，接近性成熟时，生长速率降低（图1b）。从相对生长曲线来看，7～12周龄时2组相对生长率均呈现下降趋势，并在13周龄出现明显的生长峰谷（图1c）。

对清远麻公鸡体重曲线拟合分析（表2和图1a）表明：Gompertz和Bertalanffy模型的拟合值（）均优于Logistic模型，且H组和L组体重Gompertz拟合值与实际值之差的波动范围小于Bertalanffy，因此可以确定清远麻公鸡体重的最优拟合模型为Gompertz曲线。在Gompertz模型中，H组和L组的体重增长拐点时间均为8周龄左右，但L组拐点体重大于H组。在7～20周龄，2组间体重差异不显著。

表2 清远麻公鸡体重3种曲线模型拟合相关参数值

图1 清远麻公鸡K系不同周龄体重生长发育曲线及Gompertz模型拟合

2.2 清远麻公鸡鸡冠生长曲线分析 7～20周龄期间，鸡冠的累积生长曲线表明：H组和L组鸡冠高度差异逐渐减小，部分矮冠公鸡后期出现补偿生长的现象（图2a），其呈现由陡到平缓的“S”型曲线上升，该结果与体重生长规律一致；鸡冠的绝对生长值在10～11周龄出现一谷一峰（图2b），但公鸡鸡冠生长发育仍然保持较高的生长水平，在公鸡接近性成熟时，鸡冠生长速度放缓（图2b和2c）。

图2 清远麻公鸡K系不同周龄鸡冠生长发育曲线

对清远麻公鸡冠高度曲线拟合分析（表3、表4）表明：Gompertz和Bertalanffy模型拟合度较优，但H组和L组冠高Gompertz拟合值与实际值之差与Bertalanffy相差无几，结合体重曲线拟合分析，确定Gompertz曲线为最优拟合模型。鸡冠生长的拐点时间H组和L组的组间差均约为2周，其中最佳的Gompertz拟合模型的拐点时间分别约为7周和9周。H组公鸡的冠高在7～13周龄极显著大于L组，在14～16周龄显著大于L组，在17～20周龄与L组差异不显著。

表3 清远麻公鸡鸡冠3种曲线模型拟合相关参数值

表4 清远麻公鸡鸡冠高度实测值与拟合值

2.3 清远麻公鸡11周龄体重、鸡冠和睾丸发育的分析

2.3.1 H组和L组公鸡相关性状的比较及关联性分析11周龄的公鸡，其鸡冠绝对生长值出现峰值（图2），此时H组和L组的体重差异不显著（图3a），冠高H组极显著高于L组（图3b），且睾丸重是L组的4.3倍（图3c）。

图3 11周龄清远麻公鸡H组和L组的相关性状显著性及相关系数分析

公鸡的体重与鸡冠相关差异均不显著，睾丸重和鸡冠高度呈现极显著的强正相关，表明鸡冠和睾丸的生长发育具有重要的关联性。

2.3.2 H组和L组睾丸组织的形态变化 11周龄的矮冠公鸡睾丸的生精小管较小，管腔中央形成较大空腔，管壁细胞松散且数量较少（图4a）。与L组相比较，H组生精小管形态完整发育较好，生精上皮细胞层数多，管壁厚、管径大，基膜与管壁完整（图4b），表明H组公鸡不仅鸡冠高度和表型优于L组，睾丸发育程度也优于矮冠公鸡。

图4 11周龄鸡高冠和矮冠公鸡睾丸曲精细管发育

2.4 候选基因表达结果 利用qRT-PCR对8周龄高矮冠公鸡的睾丸差异表达分析中差异倍数较大的候选基因（）进行表达分析。和在L组表达量极显著高于H组；在L组表达量显著高于H组（图5），表明这4个候选基因可能与鸡冠和睾丸发育有关。

图5 候选基因在8周龄H组和L组睾丸中的表达

3 讨 论

生产中，早熟和晚熟公鸡的选育主要根据打鸣、鸡冠大小、羽毛成熟度等来判断，除通过鸡冠表型直接判断外，借助最优的生长曲线模型能更准确预测鸡冠生长和性成熟的早晚，合理选育不同发育类型的种公鸡。生长曲线能综合不同时期的测定数据，直观地分析禽类生长发育的基本规律，为家禽选育中综合经济指标的制定提供依据，其模型准确性受样本大小、环境、年龄和记录时间长短等影响，如超过90%则能较为准确地预测生长期的增长规律。

本研究对清远麻公鸡体重和冠高的拟合均表明了Gompertz模型最优，这与刘双艳等人的结论一致。H组体重及冠高拐点均早于L组，尽管L组拐点体重较H组稍大，但整个生长期组间体重差异不显著，L组是否可望培育成体重偏大的鸡，值得进一步大群体实验予以验证。一般而言，上市日龄越短，其肉质越嫩，脂肪沉积较低，因此慢速型鸡较快速型鸡的肌肉更具风味。生产中，H组和L组公鸡可分别育成早熟系和晚熟系，这可避免育种成本的浪费。H组和L组11周龄的鸡冠高度和睾丸总重差异显著，且两者呈极显著强正相关，并从组织学上得到了印证，这与季从亮等的结论相似。

本研究表明公鸡的鸡冠局部生长与体重生长规律相似，但早期性征发育与体重相关性较小，间接表明对公鸡早熟性的选育影响体重较小。由于体重生长拐点为8周龄，因此本研究采集8周龄H组和L组公鸡睾丸进行荧光定量验证分析，并且选择与睾丸或精细胞发育相关的基因作为候选基因，并对这4个候选基因进行了初步分析。其中，基因与男性生殖细胞有关，和基因与精子的质量有关，在睾丸中优先表达，其均未见在公鸡中报道。本研究结果表明，这些基因与公鸡睾丸发育有关，但其是否与公鸡鸡冠的发育相关，尚需通过阉鸡实验进一步验证。性成熟是多基因调控的生理过程，需通过早期鸡冠发育程度将公鸡群体细分为早熟性和晚熟性品种，从而探寻鸡冠-体重-睾丸间发育规律与联系，为后续精准解析优质鸡性早熟过程提供理论基础。

4 结 论

7～20周龄性成熟早的H组公鸡的鸡冠表型优于性成熟晚的L组，其组间体重增长差异不显著；Gompertz模型对清远麻鸡公鸡冠高和体重拟合效果最优。在11周龄，H组与L组体重差异不显著，但2组冠高和睾丸总重差异显著，鸡冠高度和睾丸总重呈极显著正相关。公鸡性成熟前发育规律以及4个候选基因表达与睾丸发育存在一定的联系，这些条件均可为早熟性和晚熟性品系选育提供一定的理论基础。