黔北麻羊RARs基因在不同组织中的表达分析

2022-02-20吴寿堂祝家秘温晓艳周志楠

中国畜牧杂志 2022年2期

吴寿堂，祝家秘，温晓艳，周志楠，陈祥*

（1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025）

黔北麻羊（Qianbei Ma goat）又名麻羊，主产于贵州省北部地区的遵义市仁怀市与习水县等地，是基于贵州省较为独特的喀斯特地貌而形成的具有独特特性的地方山羊品种。身处云贵高原地区的黔北麻羊能较好地适应当地气候、自然和地理环境。在生产性能方面，黔北麻羊体格较大、体质结实、四肢粗壮，属毛皮肉兼用型品种，皮肤大多为花色，因遗传性能稳定、抗逆性强、耐粗饲、繁殖力高而闻名，是宝贵的畜禽遗传资源。

视黄醇（Retinol）是维生素A的化名，分子式为CHO，其具有维持正常视觉、促进生长发育、调节营养等重要功能，对哺乳动物的生长发育十分重要。早期研究表明，在体内，视黄醇通过代谢演变为活性因子视黄酸（Retinoic Acid，RA）在体内调控RNA与蛋白质的表达丰度，进而影响哺乳动物生殖细胞的生长发育以及氨基酸的吸收和发挥。而RA的活性主要由视黄酸受体（Retinoic Acid Receptors，）和类视黄醇X受体（Retinoid X receptors，）所介导，进入体内发挥作用。RARs是RA诱导的属于类固醇和甲状腺激素受体超家族的转录加强因子，也是RXRs的一种异二聚体，相对于，在多种信号通路中起到主要的调控作用。RARs具有和3种亚型。研究表明，在调节各种细胞的增殖发育、形态变化、代谢、内环境的稳态等多个方面具有广泛的生物学活性。最新数据显示，家族基因中（）、（）和（）分别定位在山羊的第19号、第27号、第5号染色体上，染色体的不同定位证实了视黄酸受体家族基因功能的多样性。此外，还有研究显示基因在大白猪的性腺组织中也具有广泛的表达，现如今，还被当作是小尾寒羊（绵羊）高繁殖力的差异基因。

目前，家族基因在猪、牛、绵羊等动物组织表达中均有研究报道，但其在山羊不同组织中的表达研究尚未发现，故本实验以贵州优良地方山羊品种黔北麻羊为研究对象，探究家族基因在黔北麻羊不同组织中的表达量，以期为后续进一步研究家族基因功能以及对山羊繁殖性状的调控机理提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料黔北麻羊来自贵州省习水县，选取健康、体况相近的母羊3头，依据贵州省地方标准《羊屠宰操作规程》（DB22/T 2740-2017）进行屠宰，立即采集心脏、下丘脑、肝脏、垂体、脾脏、子宫、肺脏、输卵管、肾脏以及卵巢10个组织进行相应处理。于-80℃冰箱保存备用。

1.2 主要仪器与试剂紫外光分光光度计（Qubit 4，Thermo Fisher）；电泳仪（DYY-2C型，六一仪器厂）；PCR扩增仪（C1000 TouchTM，Thermo Fisher）、实时荧光定量PCR仪（CFX96 Real-Time System，Bio-Bad）、凝胶成像系统（Universal Hood II，Bio-Bad）。TRIzol试剂、液氮、三氯甲烷、0.5×TAE缓冲液、异丙醇、75%乙醇、西班牙琼脂糖均购自贵州罗德宏信生物技术有限公司；荧光定量试剂2×Ts Master RT-qPCR Mix（擎科生物）；第一链cDNA合成逆转录试剂盒（康为世纪）。

1.3 引物的设计与合成根据GenBank公布的山羊（）基因序列（登录号：XM_018065 032.1）、基因序列（登录号：XM_013975483.2）、基因序列（登录号：XM_018047691.1），运用软件Primer 5.064设计荧光引物，以作为荧光定量的内参基因。引物由生工生物工程（上海）技术服务股份有限公司合成。详细信息见表1。

表1 引物信息

1.4 RNA的提取及cDNA合成按照TRIzol结合液氮研磨以提取黔北麻羊心脏、下丘脑、肝脏、垂体、脾脏、子宫、肺脏、输卵管、肾脏以及卵巢10个组织的总RNA，随后于超微量分光光度计下进行检测，若图像呈现单峰、曲线平滑并且D/D值在1.8～2.0区间内，则证明所提取的RNA没有被污染，可用于进行下一步实验研究。根据HiFi Script cDNA Synthesis Kit试剂盒（康为世纪）进行逆转录，超微量分光光度计下测定其浓度，合格的产物放置于-20°保存。

1.5 实时荧光定量PCR RT-qPCR反应体系为10 μL：2×UltraSYBR Mixture 5 μL、cDNA（1 000 ng/μL）1 μL、Primer sense（10 μmol/L）0.5 μL、Primer Anti-sense（10 μmol/L）0.5 μL、ddHO 3 μL。反应程序如下：95℃预变性2 min；95℃变性15 s、62.3℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40个循环，设置3个重复，取平均值，检测与基因在黔北麻羊心脏、下丘脑、肝脏、垂体、脾脏、子宫、肺脏、输卵管、肾脏以及卵巢10个组织的表达水平。

1.6 数据分析用Excel软件预先处理实验数据，然后使用2法分析黔北麻羊与基因在10个组织中的差异表达，用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1与基因引物特异性检测使用PCR法扩增、基因的荧光引物序列，使用琼脂糖凝胶电泳检测其特异性。结果显示如图1：与显示出与目的片段一致的亮带，且无非特异性扩增，证实引物特异性良好。

图1 RARA、RARB与RARG基因扩增电泳结果

2.2 实时荧光定量PCR检测R与基因特异性如图2～4所示，在各组织中与基因扩增曲线呈“S”形状，整体趋势一致。熔解曲线呈现单峰，且较为集中，无双峰及杂乱条带，证明与基因特异性较好。

图2 RARA基因扩增曲线和熔解曲线

图3 RARB基因扩增曲线和熔解曲线

图4 RARG基因扩增曲线和熔解曲线

2.3 黔北麻羊不同组织中基因mRNA表达量分析黔北麻羊基因在不同组织中均有表达（图5）。基因在黔北麻羊不同组织中的表达量由大到小依次为肝>心>下丘脑>脾>垂体>肺>输卵管>子宫>肾>卵巢，其中肝脏的表达量极显著高于所有组织，心、脾、下丘脑及垂体中基因的表达量均显著高于肺、肾、子宫和输卵管，其余组织间均未达到差异显著水平。

图5 RARA基因在黔北麻羊不同组织中的差异表达量

2.4 黔北麻羊不同组织中基因mRNA表达量分析基因在黔北麻羊的不同组织中均有表达（图6），其中输卵管表达量极显著高于其他组织，其余组织之间则呈不显著差异，黔北麻羊基因表达由高到低依次为输卵管>下丘脑>子宫>卵巢>肝>心>肺>肾>垂体>脾。

图6 RARB基因在黔北麻羊不同组织中的差异表达量

2.5 黔北麻羊不同组织中基因mRNA表达量分析基因在黔北麻羊10个不同组织中也存在着不同程度的表达（图7），基因的表达量由高到低依次为下丘脑>卵巢>输卵管>肝>心>子宫>肾>肺>垂体>脾，且下丘脑中基因的表达量极显著高于所有组织，基因在卵巢的表达量极显著高于除下丘脑以外的其余组织，其余组织间差异不显著。

图7 RARG基因在黔北麻羊不同组织中的差异表达量

3 讨论

本实验以黔北麻羊为对象，利用RT-qPCR技术，检测在黔北麻羊的不同组织中的表达情况，结果显示与基因在黔北麻羊的不同组织中均有表达，说明这3个基因的表达具有广谱性。

维生素A是畜牧行业的必需物质，已被证实能够调节动物机体上皮细胞的生长并维持动物机体的正常发育，故其在体内的含量对哺乳动物的生长发育及繁殖十分重要。作为维生素A的代谢产物之一，RA对细胞增殖、分化、免疫反应、视觉形成、精子形成等各方面均具有十分重要的作用，RA可以进入细胞核并与RARs结合以促进靶基因的转录，而作为RAR受体家族成员在调控RA生理功能方面具有重要作用。现如今，已经证实RARs对于脑、脊髓、心脏、眼睛、骨骼、肺等器官的早期发育十分重要。而本研究发现基因（）在黔北麻羊10个不同组织均具有广泛的表达，这与视黄酸生理功能及维生素A在体内的分布机制相符。此外，RARs家族基因对哺乳动物的繁殖机能十分重要。当基因在动物脂肪组织中被切除后，能影响动物机体脂肪细胞的分化等其他性状。本研究发现基因在黔北麻羊肝脏中的表达量最高，在肺和卵巢中的表达量较低，这与前人在180日龄与270日龄的大白猪中基因时空表达差异的研究结果类似，且其发现基因表达随着日龄的升高而增加，在1日龄肝脏中的表达量较低，因本研究选用的黔北麻羊屠宰时约为36周龄（252日龄），故其在肝脏中的表达量相对较高可能是由于黔北麻羊的生长发育所致。卵巢基因表达量较低可能是由于羊自身生理状态较差，进而使其消化、吸收能力减弱或卵巢卵泡退化或存在病理状态所致。是不同于的另一种RARs，其可以通过信号通路诱导RARRES 1、2和3在子宫及胎盘中表达。本研究发现除垂体外，基因在黔北麻羊性腺组织中的表达量普遍高于非性腺组织，且在输卵管中的表达量最高，这与前人使用免疫组化所检测出的结果相似。杨国伟等人发现基因在大白猪中存在时空表达差异，在心、肾、卵巢中存在持续高表达，与本研究结果类似。故本研究推测基因在性腺中的高表达可能对调控黔北麻羊的繁殖性能存在一定影响。早在1995年，Look等人发现在成年大鼠和人类中，基因在皮肤中高表达，在肺、脾与肾脏中表达量较低。基因能够在猪的关键妊娠时期表达，也能够控制猪的产仔性状。此外，大量研究证明基因的遗传变异与猪、绵羊的繁殖力高度相关。现如今，也被认为是母羊多胎性状的候选基因。绵羊基因在心、肝、脾、肺、肾、瘤胃、十二指肠、淋巴、下丘脑、垂体、肌肉、睾丸等12个组织中均有表达，证实了基因在绵羊中广谱表达。此外，李俊等研究发现在从江香猪卵巢、输卵管与子宫中均存在较高的表达。而本研究发现黔北麻羊基因在10个组织中均有表达，在下丘脑和卵巢中的表达量较高，极显著高于其他组织，其次是输卵管，在子宫、肺、脾、肾中的表达量相对较低，这与Look等与王维民等人的研究结果基本一致，但在子宫中的表达量较低与李俊等人的研究结果不符，推测可能是由于物种不同或其组织生理状态不同所致。