蒙古马免疫组织NF-κB信号通路相关基因的表达研究

2022-02-20赵一萍康德措苏少锋李雅静其日格日白东义

中国畜牧杂志 2022年2期

赵一萍，康德措，杜明，苏少锋，李雅静，其日格日，白东义，李蓓，芒来*

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖重点实验室，农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站，内蒙古农业大学马属动物研究中心，内蒙古呼和浩特 010018；2.兴安职业技术学院，内蒙古乌兰浩特 137400）

（Nuclear Factor-Kappa B，核转录因子kappa B）作为多种信号传导途径中的一个重要的转录调节因子，广泛存在于机体不同种类的细胞中。通过调节细胞因子、趋化因子等基因的表达，从而在对外界刺激响应、机体免疫和炎症反应、抗病原体等过程中发挥着积极的作用。Sen等首次发现了NF-B蛋白，其是一种核蛋白，能与免疫球蛋白轻链基因的增强子B序列进行特异结合，因而得名为NF-B。NF-B是一个可诱导的二聚体转录因子家族，包括5种蛋白：p65（RelA）、NF-B1（p50/p105）、NF-B2（p52/p100）、RelB和c-Rel，最常见的形式是由p50（NF-B1）和p65（RelA）形成的异源二聚体。在静止细胞中，NF-B与IB（Inhibitory NF-B，NF-B抑制蛋白）结合，此时胞浆中NF-B处于无活性的状态；当IBs蛋白被泛素化修饰，进而被降解，从而与NF-B二聚体解离，释放NF-B二聚体，获得自由的NF-B二聚体进入细胞核，与靶基因结合，启动转录。鉴于NF-B既可以参与天然免疫应答，又可以调节获得性免疫应答，因此NF-B信号通路与细胞因子的相关研究一直处于免疫学研究的热点，但关于马属动物NF-B信号通路的研究较少。蒙古马作为优秀的地方马种，具有抗病力强、耐粗饲等特征，NF-B信号通路是否在蒙古马较强的抗病力中发挥作用未见报道。本研究对NF-B信号通路相关基因在蒙古马肝脏、脾脏、肺脏和血液组织中表达进行分析，为研究NF-B信号通路在马匹正常状态下机体固有免疫调控等过程中的作用奠定了理论依据和基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物从内蒙古自治区包头市达茂旗随机选择3匹健康的蒙古马（雄性，平均年龄3.67±1.53岁），颈静脉采集血液（EDTA抗凝剂）；屠宰过程中采集组织（脾脏、肺脏和肝脏），将采集到的所有样品快速置于液氮中暂为保存，带回实验室后存放于-80℃冰箱中，用于后续实验。

1.2 主要仪器和试剂

1.2.1 主要仪器实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad CFX96 Touch，美国），凝胶成像系统（Bio-Rad Gel Doc XR+，美国），酶标仪（Thermo NanoDrop 2000C，美国），WB转移电泳槽（Tanon VE186，上海）。

1.2.2 主要试剂 Trizol、TB GreenPremix Ex TaqII定量试剂盒、PrimeScriptTMRT Master Mix反转录试剂盒（TAKARA，大连），BCA蛋白定量试剂盒（Cwbiotech，北京），兔多克隆NF-B p65抗体、山羊多克隆IL-1抗体（Abcam，上海），小鼠单克隆-actin抗体（ZSGBBIO，北京），羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG抗体（Jackson，美国）。

1.3 荧光定量PCR

1.3.1 引物合成以马-基因为内参基因，选取NF-B通路上的相关基因和为目的基因。根据NCBI收录的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，通过NCBI中的Blast功能检测各引物的特异性，引物具体信息见表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.3.2 总RNA提取按照Trizol试剂盒说明书进行总RNA的提取，并通过酶标仪检测总RNA的纯度和浓度，nm/nm值在1.8～2.0之间且浓度较高的RNA样品用于后续实验。按照试剂盒说明书进行反转录，合成的cDNA置于-80℃保存。qRT-PCR反应体系按照试剂盒说明书配制，共20 µL：TB Green Premix ExTaqII 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddHO 6 μL。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性60 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min，40个循环。为减少实验过程中产生的误差，每个样品进行了3次重复。

1.4 免疫印迹分析按照常规方法提取肺脏中总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度。然后通过制胶、蛋白变性、凝胶电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、成像和灰度分析等步骤对目的蛋白表达量进行分析。

1.5 数据分析以-基因为内参基因，采用2定量分析方法，对NF-B信号通路上基因的表达量进行分析。采用IBM SPSS Statistics 26软件对数据进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 蒙古马免疫组织NF-B通路相关基因转录水平表达分析 NF-B信号通路相关基因在肝脏、脾脏、肺脏和血液中均有表达，且在肺脏中的表达最高，在脾脏或肝脏中的表达最低。基因在4个组织中的表达水平高于其他4个基因（图1）。7个基因在4个组织中的表达存在差异，NF-B p50基因在肺脏中的表达显著高于在肝脏、脾脏、血液中的表达；基因在肺脏中的表达极显著高于在肝脏、脾脏中的表达，显著高于在血液中的表达；基因在肺脏中的表达显著高于在肝脏、脾脏和血液中的表达；基因在肺脏中的表达显著高于在肝脏中的表达；基因、基因和基因在各组织之间的表达差异不显著（≥0.05）。

图1 蒙古马肝脏、脾脏、肺脏和血液组织中NF-κB通路相关基因mRNA表达量

2.2 蒙古马免疫组织NF-B通路相关基因蛋白水平表达分析 NF-B p65和IL-1蛋白在蒙古马4个组织中均有表达；NF-B p65蛋白在脾脏中表达较高，其次为在肝脏、血液、肺脏中的表达量；IL-1蛋白在4个组织中的表达量从高到低顺序依次为肺脏、脾脏、肝脏和血液（图2）。

图2 蒙古马肝脏、脾脏、肺脏和血液组织中NF-κB p65和IL-1β蛋白表达

3 讨论

NF-B参与多种生理和病理过程，在固有和获得性免疫应答、细胞增殖与分化、炎症反应、疾病反应过程中都起到重要作用，具有广泛的生物学活性。未活化的NF-B p50/NF-B p65异源二聚体与抑制蛋白结合定位于细胞质内，当抑制蛋白被降解，释放出NFB p50/NF-B p65二聚体，活化的NF-B p50/NF-B p65异源二聚体进入细胞核，立即启动多种细胞因子基因、生长因子基因、黏附分子基因和急性反应蛋白基因等的转录。Li等对杜洛克猪不同组织中基因的表达进行了研究，发现不同组织之间的差别明显，较高水平表达的组织有肺脏、脾脏、肝脏和小肠，表达中等水平的组织包括肾脏和胃，较低水平表达的组织为心脏、背最长肌和腿肌，说明基因在猪免疫器官的表达量相对较高。本研究对蒙古马免疫组织中基因的表达测定结果与杜洛克猪免疫器官的表达趋势基本一致，在肺脏中的表达最高，其次为肝脏和脾脏，这充分说明基因在免疫调节中的重要性。刘霞等研究发现，大鼠肺脏组织中基因的表达量略高于基因。本研究检测4个组织（肝脏、脾脏、肺脏、血液）中基因均处于较高水平的表达，其中基因表达量均高于基因。NF-B p50与NF-B p65形成异源二聚体，故二者的表达趋势一致。NF-B p65蛋白在脾脏中表达最高，在肺脏中表达最低，这与mRNA水平检测结果相反，基因经过转录后调控、翻译、翻译后调控最终形成NF-B p65蛋白，在不同组织中此过程各环节间存在的差异导致了mRNA和蛋白表达的不一致。

NF-B激活后由胞浆快速移位进入胞核，并与靶基因的B基序结合启动基因转录，释放IL-1、TNF-α等促炎因子。基因在不同组织中表达量存在差异，本研究检测到基因和IL-1蛋白在肺脏中的表达都高于其他3个组织。这可能由于蒙古马肺脏受到病原微生物的刺激，机体启动防御系统来帮助机体清理入侵的病原微生物和损伤修复。IL-1增加可以进一步启动IL-1/NF-B的信号通路。NF-B信号通路在马匹中研究的相对较少，Bureau等评估健康马和受肺气肿影响的马（哮喘动物模型）支气管细胞中NF-B活性，发现在健康马中NF-B存在较少，受肺气肿影响的马在危险期NF-B活性处于高水平。Uhl等发现马驹接种马红球菌后细胞核内NF-B活性增加，同时细胞因子表达也明显增加。马匹在受到外界刺激（肺气肿或接种马红球菌）后，机体将激活NF-B，NF-B活性增强，启动下游细胞因子等表达。本研究检测的7个基因与其他组织相比在肺脏中的表达量均相对较高，这可能是由于内蒙古地区风沙较大，蒙古马放牧在草原上，为了适应恶劣的风沙环境所致。本实验所用蒙古马均未患有肺部疾病，但肺部NF-B高表达水平是否起到预警的作用需要后续研究进一步论证。