宏基因组第二代测序技术诊断鹦鹉热衣原体肺炎1 例

张祥钦，江 勇

（广州医科大学附属深圳沙井医院 呼吸与危重症医学科，广东 深圳 518000）

鹦鹉热衣原体是一类专性细胞内寄生的革兰染色阴性病原体，主要感染鹦鹉、鸽子、鸡、鸭等禽类，并可通过病鸟的干燥粪便、羽毛或呼吸道分泌物的气溶胶，进入人体而造成人畜共患病[1]。相关文献报道显示，该病人传人的现象较为罕见，人类感染鹦鹉热衣原体后通常有5～14 d 的潜伏期，引起的临床表现主要是高热、干咳等与上呼吸道感染相似的症状，严重时可进展为非典型的重症肺炎[2]。鹦鹉热衣原体肺炎在临床上并不常见，据文献统计，其发病率约占社区获得性肺炎病例的1%[3]，因此许多临床医师对其认识严重不足。另外，由于鹦鹉热衣原体肺炎的流行病学资料不明确、临床症状特异性差，且目前实验室诊断方法局限，临床上更容易造成误诊、误治。宏基因组第二代测序技术（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是一种新型的微生物检测方法，可对临床样本的DNA 或RNA 进行测序以快速确定致病微生物，近年来逐渐被应用于临床。有关利用mNGS 诊断鹦鹉热衣原体肺炎的相关报道目前仍较少。本文报道1 例我院近期确诊的鹦鹉热衣原体肺炎病例，旨在提高临床医师对鹦鹉热衣原体肺炎的认识，并探讨mNGS在鹦鹉热衣原体肺炎诊治中的应用价值。

病例：患者为39 岁女性，因“发热、尿灼热感4 d”被收治入我院。入院前4 d，患者无明显诱因下出现发热，体温最高达39.8 ℃，畏寒，但无寒战，发热时伴有头晕、头痛，全身无力明显，排尿时有灼热感，伴腰痛，无明显尿频、尿急，偶有咳嗽，咳白痰。当时患者就诊于我院，实验室检查示，白细胞计数7.83×109/L，血小板计数189×109/L，中性粒细胞百分比81.1%（↑），C 反应蛋白33.56 mg/ L（↑），超敏C 反应蛋白>5.00 mg/L（↑）。予对症退热治疗后，患者的病情仍有反复，复诊查尿常规示，尿液潜血+++，尿液白细胞弱阳性，尿液白细胞63.08 个/μL（↑）；查床边生化示血钾2.8 mmol/L，考虑诊断“急性肾盂肾炎、低钾血症”，收入我院肾内科。患者既往体健，否认疫区居留史。入院体格检查示，体温36.6 ℃，心 率66 次/min，呼吸20 次/min，血压101/61 mmHg，神志清；心音有力，心律齐，未闻及心脏杂音；双肺呼吸音对称，双肺呼吸音粗，未闻及干湿啰音；腹部平软，无压痛，无反跳痛；双侧肾区叩击痛阴性。入院后予头孢他啶抗感染及补钾治疗，患者仍有发热，测得体温最高达39.4 ℃。胸部X 线摄片显示，左下肺炎；泌尿系+腹部+心脏彩超未见异常；大便常规及潜血、抗核抗体、甲状腺功能三项、结核抗体、乙肝表面抗原、丙肝病毒IgG 抗体、梅毒螺旋体抗体、艾滋病毒抗原抗体未见异常。予加用莫西沙星覆盖不典型病原菌感染治疗，患者体温无下降，最高达40.2 ℃，第2 天改用头孢哌酮钠舒巴坦钠+莫西沙星抗感染，奥司他韦抗病毒治疗。进一步查胸部CT示，患者左肺下叶各段见斑片状密度增高影及实变影，边缘较模糊，病灶内见含气支气管影，余肺段纹理清晰（见图1）。呼吸道病毒感染筛查为阴性。其后，患者转入呼吸与危重症医学科，行纤维支气管镜检查。将其肺泡灌洗液送至华大基因行PMseq-DNA 呼吸系统感染病原微生物第二代测序技术检测（鄂汉械备：20190039 号），回报结果为，鹦鹉热衣原体检出序列数95 条reads，流产衣原体检出序列数6 条reads（检测到病原微生物1 条序列即判定为阳性，而检测灵敏度与检测总序列数呈正相关）。患者最终被诊断为鹦鹉热衣原体肺炎。明确诊断后，继续予头孢哌酮钠舒巴坦钠+莫西沙星抗感染治疗（停用奥司他韦），方案调整后第2天其体温逐渐下降，当晚体温降至37.3 ℃以下，且未再升高。治疗2 周后患者复查胸部CT 提示左肺下叶各段多发感染病灶较前明显吸收（见图2），治疗有效。

图1 治疗前胸部CT 影像学表现

图2 治疗2 周后胸部CT 影像学表现

讨论：虽然随着各类抗生素类药物的应用，鹦鹉热衣原体感染后病例死亡的发生率已经很大程度地降低。研究表明，目前鹦鹉热衣原体感染住院病例的总体死亡率仅约为0.93%，死亡病例也主要集中在50 岁以上的中老年人群[4]，然而，本病患者除了可出现咳嗽等肺内表现外，还可伴发一些非特异性肺外表现，例如脑膜炎、肝炎、心肌炎等[5]，另外早期的误诊误治可增加患者的医疗支出及心理压力，损害患者的身心健康。因此，早期快速、准确诊断该病仍然十分必要。

目前，大多数鹦鹉热衣原体肺炎病例主要通过流行病学史、临床表现和微量免疫荧光（micro-immunofluorescence，MIF）法检测来进行诊断。但除了与病鸟直接接触传播外，间接的环境暴露同样可造成鹦鹉热衣原体感染[6]，因此该病的流行病学本身并不明确。本例报道的病例并无确切的鸟类接触史或环境暴露史，而早期临床表现为发热、咳嗽、腰痛等非特异性症状，使得辅助检缺乏针对性，后期发现的胸部CT 的肺炎异常表现也并不具备特征性，因此实验室检查在其中显得至关重要。但常规MIF 诊断鹦鹉热衣原体的标准是，恢复期（发病2～4 周后）的鹦鹉热衣原体抗体效价较急性期有4 倍或以上的升高。该诊断方法较传统的补体结合试验的灵敏度及特异度都要高，但同时也存在一定的局限。①该方法需要对急性期和恢复期的抗体效价均进行检测对比才能明确诊断，因此可能会导致诊断延误；②在该病的治疗当中，使用抗生素有可能会导致抗体反应延迟或减弱，因此会使恢复期的抗体效价出现误差[2]。由此可见，MIF 更适合在疾病恢复后进行回顾性诊断，在疾病早期的诊疗指导上作用有限。

mNGS 是通过对临床样本的DNA 或RNA 进行鸟枪法测序，对包括病毒、细菌、真菌及寄生虫等多种病原微生物进行检测，侧重于微生物基因组的识别和分析[7]，具有高通量、低成本、自动化程度高等特征[8]。笔者将相关共识[7]建议在常规检查的同时开展mNGS 检测的人群总结为以下六类。①表现为发热或发热症候群，病原体尚不明确，且经验性抗感染治疗无效者；②不除外感染导致的急危重症者；③免疫受损疑似继发感染，病原体尚不明确，且经验性抗感染无效者；④疑似局部感染，且病原体尚不明确，可能引起严重后果者；⑤高度疑似感染，病原体尚不明确，且常规抗感染无效者；⑥慢性感染或慢性疾病不除外感染，且两者难以鉴别，需明确病因者。本病例早期反复发热且病原体不明，使用常规抗感染治疗效果欠佳，因此有进行mNGS 检查的指证。mNGS 可检测病毒、细菌、真菌、寄生虫等四大类，减少了特殊病原体、少见微生物的遗漏情况，使得检测更加全面。然而，由于mNGS 是通过检测到的样本读长（碱基序列）与数据文库的参考基因进行比对而得出分析[7]，因此参考基因数据库的微生物种类完整性直接影响到mNGS 的检测能力，这对实验室的微生物参考基因组的公共数据库提出了很高要求，成为限制mNGS 目前未能广泛普及的原因之一。通常微生物检测的读长数量（碱基序列数量）越多，那么其为致病微生物的可能性越大[7]，所以读长数量在分析当中也可为临床医师提供参考，用于辅助判断所检测到的微生物是致病菌还是定植菌，抑或是样本污染。本病例的二代基因测序结果显示，鹦鹉热衣原体检出序列数95 条reads，流产衣原体检出序列数6 条reads，因此认为鹦鹉热衣原体是该病例的致病微生物的可能性大，结合患者的临床表现及影像学表现，最后确定诊断为鹦鹉热衣原体肺炎。

鹦鹉热衣原体感染患者治疗首选四环素类药物，而大环内酯类药物以及新喹诺酮类药物同样有效。本病例在后期经验性地选择了加入莫西沙星治疗，发热得到了控制，但根据循证医学原则也仍需要实验室检测去支持该治疗方案。而mNGS 除了可对病原微生物进行鉴定之外，还可对病原体进行耐药基因检测，通过测序确定具体的耐药基因在哪个病原体上，并且确定是在质粒上还是染色体上[7]，对临床的治疗指导有重大意义。此外，mNGS 技术凭借其在检查新发病原体或一些特殊病原体当中的快速、明确、全面、彻底等优势，在感染性疾病流行暴发的临床诊治和疾病防控当中也有很高的应用价值[7，9]。但由于该技术目前缺乏标准的操作规范和可信的解释标准，且检验的质量也参差不齐，因此尚未得到广泛推广。相信随着研究的深入与行业规范的制定，该技术将在临床实践当中拥有广阔的应用前景。

总之，在临床上遇到不明病原体的社区获得性肺炎患者时，需要注意详细询问流行病学史，并警惕鹦鹉热衣原体感染可能。在常规检查及经验性抗感染治疗效果欠佳时，推荐将mNGS 检测作为辅助诊断手段，达到早诊断、早治疗的效果。