吉兰—巴雷综合征患者脑脊液和血浆中BDV-CIC及抗体检测

郭霞 田永攀 刘海军 赵宇 徐平

(遵义医科大学附属医院神经内科，贵州 遵义 563003)

博尔纳病病毒(borna disease virus，BDV) 是一种系统遗传多样性、未分段、有包膜的单分子负链RNA嗜神经病毒，可持续感染宿主[1-2]。最新研究报道，BDV-1感染是器官移植后人类死亡的原因之一[3]，当宿主受到BDV抗原侵袭后会发生一系列免疫反应，引起多种神经系统疾病，如免疫介导的吉兰—巴雷综合征(guillain-barre syndrome,GBS)、脑脊髓炎以及非炎症性行为改变等[4-5]。本研究主要探讨贵州省部分地区GBS患者BDV感染情况，以及同组病人不同标本博尔纳病病毒循环免疫复合物(circulating immune complexes,CIC)及抗体阳性率差异。

1 对象与方法

1.1研究对象 本研究经遵义医学院伦理委员会批准通过，所有参与者获得知情同意。采集贵州省部分地区9例GBS患者的血液及脑脊液(男4例，女5例)，对照组93例血浆来自遵义医科大学第一附属医院体检科；对照组45例脑脊液来自遵义医科大学第一附属医院神经外科及脑血管科神经系统非炎性疾病(如脑外伤)患者。抗体和阳性(E4278)、阴性(LWJ)对照的样本由重庆医科大学神经病研究所提供，分别是抗P40的单克隆抗体Wl和抗P24的单克隆抗体Kfu2病毒液。

1.2标本处理 分别采集实验组及正常对照组每个患者脑脊液各3～4 mL及血液各5～8 mL，离心后分别分装在200 μL离心管，-80℃冰箱保存。

1.3脑脊液BDV-CIC检测 包被鼠抗IgG，以包被液稀释成 1 μL/mL 溶液，37℃反应1 h，包被BDV P24及BDV P40各20 μL，以样本缓冲液稀释成 4 μL/mL 溶液，4 ℃冰箱过夜，洗板后加入脑脊液(100 μL/孔)，设置阴性及阳性对照，37℃反应 1 h，洗涤后加入羊抗人 IgG 溶液于37 ℃反应1 h，洗涤后加入显色剂(计时3 min)，再加入50 μL的终止液，最后在 405 nm分光光度计读取3次，取平均值。检测标准：OD405 nm值≤0.1，阴性；在0.1～0.12之间，临界值；在0.12～0.15之间，弱阳性(-+)；在0.15～0.3之间，阳性(+)；在0.3～0.6之间，中度阳性(++)；在0.6～1.0之间，强阳性(+++)；>1.0，极强阳性(++++)。

1.4BDV特异性抗体的检测 加样取240 μL被感染的OL细胞(病毒液)加入12 mL的样本缓冲液中(稀释液比例1∶50)，加入96孔板，除空白对照不加，其余孔各加入100 μL，37℃反应1 h，洗涤后取20 μL的CSF与180 μL的样本缓冲剂混匀，除空白对照不加，其余孔各加入 100 μL，37 ℃反应 1 h。余下步骤及检测标准同脑脊液CIC。

1.5血液BDV-CIC检测 检测步骤及检测标准同脑脊液CIC。

1.6统计学方法 采用SPSS21.0软件进行统计学分析，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

表1 两组脑脊液、血浆中BDV-CIC检出率及血浆中抗体检出率的比较(n,%)

3 讨 论

吉兰—巴雷综合征即急性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy，AIDP)是一种病因未明的神经系统炎症性脱髓鞘疾病，约65%的GBS患者起病前1～4周有呼吸道或者胃肠道的感染症状。研究[6]指出，GBS的发病机制是感染后引起的异常免疫应答，引起疾病爆发较常见诱因有细菌、病毒感染，疫苗接种史，乙型肝炎表面的免疫复合物也可能与GBS的病因及慢性复发性多发性神经病相关。近年来，有学者针对我国BDV感染引起GBS进行临床研究时发现，其目的基因片段为BDV高度保守序列，经临床测序后证实与BDV标准病毒株的相应序列具有明显的同源性。在早期研究中Bode等在92例周围神经病外周血中行qRT-PCR检测出4例BDV-P40抗体；随后徐平[7]等用nRT-PCR在慢性GBS病患者中发现了BDV-p24阳性基因片段，经测序后证实与BDV标准病毒株的相对应序列具有明显的同源性，表明周围神经系统和血液、骨髓中等肺肾经细胞也是BDV的复制部位；魏志杰[8]等用Western blot法在19例GBS患者中检测出1例BDV-p24抗体，阳性率高于健康对照组。金兴振[9]等用Western blot法在19例GBS患者中检测处1例BDV-p40抗体，阳性率高于健康对照组。本次研究中，GBS患者组脑脊液中BDV-CIC检出率为11.10%，高于对照组的BDV-CIC检出率，GBS患者组血浆中BDV-CIC及抗体检出率为33.3%，高于健康对照组的BDV-CIC检出率。3例阳性患者中有2例是以四肢麻木、乏力为主要表现，1例以四肢进行性麻木伴口角歪斜半月入院，入院后行脑脊液检查细胞数、糖、氯化物无明显异常，可见明显蛋白-细胞分离现象，为临床确诊GBS病例，本研究进一步证实了贵州省部分地区人群GBS患者中存在BDV的感染。

近年来，我国部分地区的对BDV感染后引起异常免疫应答相关神经系统疾病报道较多，如脑炎、帕金森病等[10-12]，但关于BDV感染引起GBS的有效病例国内外报道均较少，且阳性检出率低，吴伟[13]等使用nRT-PCR和qRT-PCR扩增检测10例已确诊为GBS患者血浆，未检测出BDV p24 基因片段。主要是因为此类疾病人群发病率普遍较其他神经系统疾病低，且目前实验室检查方法多样化，既往检测BDV感染的常用方法是FQ-nRT-PCR法和Wester blot法，具有操作复杂、耗时长、成本高、漏诊率高、检出率低等缺点。本次研究主要采用Hanns Ludwig和Liv Bode及其研究团队开创的一个突破性的BDV检测方法即新型三联ELISA法，其检测GBS患者BDV-CIC属于特异CIC[14]。该方法主要优点为：同时检测BDV P24、P40两种特异性的CIC，对比以前检测其中一种特异性的指标(P24或者P40)，较大的提高其特异性、敏感性，简便性、快捷性，以及重复性好，且常规应用试验前不需要对标本进行加热灭活或特殊的吸收处理等优点，并能够快速而准确地监测整个感染过程，为预防和治疗提供可靠的依据[15]。

本次研究结果显示，GBS患者血浆外周血单核细胞BDV-CIC检测阳性率33.33%(3/9)，明显高于对照组(P<0.05)。说明BDV特异性CIC稳定性较高，当宿主感染BDV后，会产生特异性的BDV抗体，随着感染的时间延长，导致BDV抗原不断释放到血液，产生抗体，继而抗原抗体结合形成免疫复合物，导致标本中存在的BDV抗原、抗体数量相应减少。BDV抗原的存在表明宿主处于急性感染期，检出率较低；BDV抗体的存在，表明宿主处于继发感染，而BDV-CIC的存在，提示持续感染，所以CIC检测不仅比一般的检测敏感性高，且在患者感染的每个时期均可被检查到。而同时进行的脑脊液BDV-CIC检测阳性率与对照组比较差异无统计学意义。其原因可能是：(1)为更好对比实验结果，加大血浆样本量致100 μL/孔，这可能是血浆中BDV-CIC检出率高于脑脊液的原因。(2)BDV主要通过鼻口黏膜的分泌物、血液、垂直等途径传播[16-17]，故感染途径及器官易感性不同。(3)不同发病时期所检测阳性率不同，同一标本脑脊液或者血液收集时间及对其处理不一样。(4)BDV特异性CIC的分子量一般较大，难以通过血脑屏障。因此血浆中BDV特异性CIC检测其敏感性、特异性高，易于操作，简单易行，并可监测感染以及治疗整个过程。

本研究显示脑脊液和外周血BDV抗体检测阳性率实验组和对照组差异无统计学意义，GBS患者腰穿大多在病毒感染后2周左右，可能是因为患者已经处于病毒携带状态或者恢复期[18]，在感染早期，抗原抗体表达较高，两者结合形成特异性CIC，由于不断形成CIC，抗原抗体减少。国内外相关文献提示循环免疫复合物检出率是抗体检出率的10倍，与本次研究符合。

近年来随着研究不断深入，已证实BDV与多种神经系统疾病存在相关性，如得不到有效治疗，可能引发爆发流行，局面难以控制，故临床出现原因不明，诊断不清时，应想到是否BDV感染所致。就目前研究来看BDV与GBS具体发病机制尚不完全明确，国内外研究报道少。BDV感染的金标准是病毒分离，但病毒分离复杂且敏感性低，BDV为非容细胞性感染，不易分离[19]。因此在今后的研究中利用新型三联Elisa检查来进一步扩大样本量，收集更多临床资料及实验数据证实，为临床的诊断及指导治疗提供更有力的依据。