利用高效液相色谱法测定山西中条山五味子2种有机酸的含量
2022-02-18张彩红杨延青常茂林
张彩红,史 鹏,杨延青,常茂林
(山西省林业和草原科学研究院,山西 太原 030012)
五味子为常用中药材,对失眠、多汗、腹泻、疲劳、神经衰弱等疾病具有一定的治疗效果[1,2]。有研究表明,五味子中含有丰富的有机酸,包括柠檬酸、苹果酸[3]等。山西中条山太宽河保护区分布的野生五味子资源丰富,笔者通过高效液相色谱法测定其果实中有机酸的含量,以期为促进山西省野生五味子资源的合理开发和利用提供理论支持。
1 试验材料
1.1 材料
试验材料为山西中条山太宽河保护区内分布的野生五味子果实,选择6个不同产地的优树果实,分别标记为sj-001、sj-002、sj-003、sj-004、sj-005、sj-006。
1.2 试剂
试验试剂包括柠檬酸标品(中国食品药品检定研究院)、L-苹果酸标品(中国食品药品检定研究院)、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、H3PO4(分析纯)、HCl(分析纯)、无水乙醇(分析纯)。试验用水为经超纯水机处理的一级水。
1.3 仪器
试验仪器包括Aglient 1260 Ⅱ高效液相色谱仪(DAD检测器),美国安捷伦公司;混匀振荡器,Heidolph公司;超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;超纯水机(Milli-Q),Millipore公司;电子天平(精度0.000 1 g),赛多利斯公司。
2 试验方法
2.1 液相色谱条件
色谱柱:Poroshell 120 EC-C18(150.0 mm×4.6 mm,5 μm),美国安捷伦公司。流动相A为乙腈溶液,流动相B为0.2%的H3PO4溶液,梯度洗脱15%~60% A(0 min~25 min)、15% A(30 min)。流速1 mL/min,进样量10 μL,柱温30 ℃。紫外检测器检测波长为220 nm。
2.2 标准储备液的制备
准确称取L-苹果酸标品、柠檬酸标品100 mg,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,得到10 mg/mL的储备液,于4 ℃下避光保存。取适量储备液,置于10 mL容量瓶中,用流动相(A∶B=15∶85)稀释至刻度,摇匀。逐级稀释成系不同浓度的对照品。
2.3 供试溶液的制备
将五味子样品烘干、粉碎、过筛后备用。准确称取1.000 0 g的五味子样品于三角瓶中,加入20 mL提取剂(甲醇和H2O的体积比为60∶40),超声振荡提取30 min,离心,收集残渣进行再提取。取出提取液冷却至室温,混合2次提取液,定容至50 mL,用0.45 μm的微孔滤膜过滤,待上机。
2.4 方法学验证
1)系统适用性试验。精密吸取10 μL混合对照品溶液,按2.1项的色谱条件进行测定,记录色谱图。
2)线性关系考察。配置50 μg/mL、100 g/mL、200 μg/mL、500 μg/mL、1 000 μg/mL、2 000 μg/mL的混合对照品溶液,按2.1项的色谱条件进行测定,以峰面积为Y,对照品溶液浓度为X,进行回归分析。
3)精密度试验。精密吸取同一浓度的对照品溶液,按2.1项的色谱条件,连续进样测定5次,分别计算2种有机酸的峰面积RSD。
4)重复性试验。精密称取同一五味子样品5份,按2.3项的方法制备供试溶液,按2.1项的色谱条件进行测定,分别计算2种有机酸的峰面积RSD。
5)稳定性试验。精密称取同一五味子样品1.000 0 g,按2.3项的方法制备供试溶液,按2.1项的色谱条件进行测定,每8 h进样1次,共测定5次,分别计算2种有机酸的峰面积RSD。
6)加样回收率试验。精密称取5份1.000 0 g的五味子样品,按照2.3项的方法制备供试溶液,按2.1项的色谱条件进行测定,分别计算2种有机酸的加样回收率和RSD。
2.5 五味子有机酸含量的测定
将6个产地的五味子样品分别按2.3项的方法制备供试溶液,再按2.1项的色谱条件进样10 μL,采集色谱图。根据色谱图中待测成分的峰面积计算6个供试品中的有机酸含量。
3 结果与分析
3.1 方法学验证结果
1)系统适用性。对照品溶液的L-苹果酸和柠檬酸HPLC图谱见图1和图2。
图1 对照品溶液的L-苹果酸HPLC图谱
图2 对照品溶液的柠檬酸HPLC图谱
由图1和图2可知,混合对照品溶液中L-苹果酸和柠檬酸的分离度均大于1.5,系统适用性良好。
2)线性关系。2种有机酸的线性回归方程、相关系数(R2)与线性范围见表1。
表1 线性关系考察结果
由表1可以看出,L-苹果酸的回归方程为Y=0.444 3X+0.637 7,柠檬酸的回归方程为Y=0.407 8X+3.150 3,2种有机酸的峰面积与对照品溶液浓度线性关系良好,R2均大于0.999 0。
3)精密度。精密度试验中,2种有机酸的峰面积RSD均为1.45%~2.63%,表明仪器精密度良好。
4)重复性。重复性试验表明,供试溶液2种有机酸的峰面积RSD均为1.21%~2.25%,表明此方法的重复性良好。
5)稳定性。稳定性试验中,供试溶液2种有机酸的峰面积RSD均为0.89%~1.60%,表明供试溶液在40 h内稳定性良好。
6)加样回收率。2种有机酸的加样回收率和RSD见表2。
表2 加样回收率试验结果 %
由表2可知,2种有机酸的平均回收率均大于97%,RSD达到1.7%以上,加样回收率测定结果符合相关要求。
3.2 五味子有机酸含量
山西中条山太宽河保护区6个产地的五味子有机酸高效液相色谱图见图3。根据色谱图中待测成分峰面积计算6种供试品中的L-苹果酸含量和柠檬酸含量,结果见表3。
由表3可知,山西中条山野生五味子中的L-苹果酸和柠檬酸含量平均为(32.388±4.904) mg/g和(71.352±13.491) mg/g。不同产地五味子的L-苹果酸和柠檬酸含量存在极显著性或显著性差异。其中,sj-005的L-苹果酸含量最高,为(39.565±2.338) mg/g,sj-005和sj-006的柠檬酸含量最高,分别为(89.437±4.808)mg/g和(87.883±5.570) mg/g。
图3 五味子样品高效液相色谱图
表3 五味子样品中L-苹果酸和柠檬酸含量 mg/g
4 结论与讨论
本研究结果表明,高效液相色谱法测定有机酸的液相色谱条件应设置为流动相A为乙腈溶液,流动相B为0.2%的H3PO4溶液,梯度洗脱为15%~60% A(0 min~25 min)、15% A(30 min),该方法具有分析速度快、线性范围宽、精密度高、准确度好等优点。用此方法测得山西中条山太宽河保护区6个产地五味子的L-苹果酸和柠檬酸含量平均为(32.388±4.904) mg/g和(71.352±13.491) mg/g,不同产地五味子的L-苹果酸和柠檬酸含量存在极显著性或显著性差异。