血清嗜酸性粒细胞神经毒素的表达及与变应性鼻炎舌下免疫治疗疗效的相关性研究

蒋远伟，胡伟群，蔡志福，戴惠婷，林超凡，潘金霞

（莆田学院附属医院，福建 莆田 351100）

变应性鼻炎（Allergic rhinitis，AR）是易感个体在接触变应原后所诱发的鼻黏膜高反应性疾病，表现为鼻塞、大量水样鼻溢以及阵发性喷嚏，已成为影响全球的健康问题之一［1］。目前，AR 以避免接触变应原、正确使用糖皮质激素为主要治疗原则，以尘螨为主要变应原，合并其他变应原种类少的患者可行特异性免疫治疗（Allergen-specific immunotherapy，AIT），而药物和免疫治疗疗效欠佳者可行外科治疗［2］。AIT是通过让患者反复接触变应原，使个体免疫系统逐渐适应，最终对外界环境中的变应原刺激产生耐受的过程。AIT 主要分为皮下免疫治疗（Subcutaneous immunotherapy，SCIT）和舌下免疫治疗（Sublingual immunotherapy，SLIT），后者由于局部和全身不良反应率更低、治疗方便，更易为患者所接受。尽管SLIT 具有较好的疗效，但仍有一定比例的患者不能从中获益，因此，治疗前通过客观指标或方法预测SLIT 疗效显得尤为重要。然而临床尚无有效生物学标志物用于SLIT的疗效预测。

嗜酸性粒细胞活化与脱颗粒在变应性疾病的病理过程中具有重要作用，因此，该生物学行为的检测在变应性疾病的诊治中具有潜在价值［3］。嗜酸性粒细胞神经毒素（Eosinophil-derived neurotoxin，END）是一种细胞毒蛋白，由活化的嗜酸性粒细胞脱颗粒时释放，本质为具有抗病毒和抗菌活性的RNA酶［4］。近年来陆续有研究关注EDN 在哮喘中的作用，并发现在哮喘患者外周血中EDN 水平显著升高，且与哮喘的严重程度和气道高反应性相关［5-6］。也有研究发现EDN 可以通过诱导基质金属蛋白酶的产生促进嗜酸性粒细胞性鼻窦炎患者的气道重塑［7］。这些发现均提示EDN在气道炎性疾病的发生发展过程中具有重要作用。但是目前尚无研究探索EDN 在AR 患者中的表达以及与SLIT 疗效的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象本研究选取2017 年5月至2018 年5 月就诊于莆田学院附属医院耳鼻咽喉科门诊诊断为AR 并接受SLIT 的患者79 例。纳入标准：⑴年龄≥18岁且≤60岁；⑵符合变应性鼻炎诊断和治疗指南（2015 年，天津）［8］中AR 的诊断标准；⑶中-重度持续性AR。排除标准：⑴合并慢性鼻-鼻窦炎等其他鼻部疾病；⑵合并风湿免疫性疾病或恶性肿瘤；⑶入组前4周内曾全身使用糖皮质激素或抗组胺药等药物；⑷既往曾接受AIT。

对照组则选择同时期在体检中心进行健康体检的性别年龄相匹配的健康志愿者40 例。纳入标准：⑴年龄≥18 岁且≤60 岁；⑵经血清特异性IgE 检测为阴性。排除标准：⑴合并慢性鼻-鼻窦炎等鼻部疾病；⑵合并变应性哮喘等变态反应性疾病；⑶合并风湿免疫性疾病或恶性肿瘤；⑷入组前4 周内全身使用糖皮质激素或抗组胺药等药物；⑸存在既往过敏病史。

本研究由莆田学院附属医院伦理委员会审核批准，所有检查和治疗均经患者知情同意并签署知情同意书，本研究的开展符合赫尔辛基宣言。

1.2 研究方法

1.2.1临床资料收集收集入组病例的相关临床资料，包括性别、年龄、外周血嗜酸性粒细胞计数和比例、血清总IgE 浓度、合并哮喘情况、合并变应性皮炎情况、治疗前后药物症状评分（Symptom and medication score，SMS）以及视觉模拟量表评分（Visual analog scale，VAS）、鼻部症状总评分（Total nasal symptoms score，TNSS）等。将治疗后SMS 较治疗前基线下降水平≥30%的患者归为有效组，SMS下降＜30%患者归为无效组［9］。

1.2.2研究对象血清样本收集及EDN 浓度检测

采集入组的研究对象外周静脉血5 mL，于室温下静置2 h。随后利用高速离心机在4 ℃环境下以800 rmp·min-1转速离心5 min，将淡黄色上清液转移至15 mL 离心管中，在4 ℃环境下以3 000 rmp·min-1转速离心5 min，收集上清液至1.5 mL EP 管中，于-80 ℃冰箱中保存备用。取前期收集的外周血血清样本，静置于室温下解冻。使用酶联免疫吸附测定试剂盒检测血清样本中的EDN 浓度。为提高该检测方法精准度，所有检测孔均设立副孔。

1.3 统计学方法本研究采用GraphPad Prism 7.0和SPSS 23.0 进行数据分析，计量资料数据以-x±s表示，组间比较两独立样本采用t检验和多独立样本采用单因素方差分析；计数资料以n（%）表示，组间比较采用卡方检验或Fisher's 精确检验。EDN 的表达水平和临床资料间的相关性探讨采用Spearman相关性分析。利用二元Logistic 回归模型和ROC 曲线分析目标蛋白与SLIT 疗效的相关性及检验效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 对照组和AR 组临床资料比较本研究共纳入AR 患者（AR 组）79 例，健康志愿者（对照组）40例。两组患者的性别、年龄、合并变应性皮炎情况、合并哮喘情况差异无统计学意义（P＞0.05）。AR组的外周血嗜酸性粒细胞计数及比例和血清总IgE浓度显著高于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 对照组和AR组临床资料比较

AR 组79 例，其中完成3 年疗程患者共46 例。我们评估疗效后将患者分为有效组（n=31）和无效组（n=15）。两组间性别、年龄、合并变应性皮炎情况、合并哮喘情况、外周血嗜酸性粒细胞比例及治疗前的VAS 评分、TNSS 评分和SMS 评分差异无统计学意义（P＞0.05），有效组外周血嗜酸性粒细胞计数和血清总IgE 浓度显著高于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 有效组和无效组临床资料对比

2.2 血清EDN 浓度与临床指标相关性AR 患者血清EDN 浓度［（100.6±6.2） ng·mL-1］显著高于对照组［（61.3±5.5） ng·mL-1］（P＜0.000 1）；SLIT 有效组血清EDN 浓度［（63.0±9.7） ng·mL-1］显著低于SLIT 无效组［（93.41±6.74） ng·mL-1］（P=0.012），见图1。Spearman 相关性分析：血清EDN 浓度与外周血嗜酸性粒细胞计数（r=0.288，P=0.002）及比例（r=0.284，P=0.002）、血清总IgE 浓度（r=0.460，P＜0.000 1）以及SMS 评分（r=0.253，P=0.024）均呈正相关，与鼻部症状VAS 评分（r=0.446，P=0.215）以及TNSS 评分无明显相关性（r=0.152，P=0.178），见图2。

图1 各组血清EDN浓度比较

图2 AR患者血清EDN浓度各临床指标相关性分析

2.3 血清EDN 预测SLIT 疗效的应用价值评估

利用二分类Logistic 回归分析外周血嗜酸性粒细胞计数、血清总IgE 浓度以及血清EDN 水平对研究对象SLIT 疗效的影响，结果血清EDN 水平与SLIT疗效明显相关，差异有统计学意义（P=0.007），见表3。进而绘制血清EDN 水平预测SLIT 疗效的ROC曲线并计算曲线下面积（Area under the curve，AUC），该指标的AUC 为0.812，敏感度为0.742，特异度为0.8，见图3。

图3 血清EDN浓度对SLIT疗效的ROC曲线分析

表3 与SLIT预后相关临床变量的二元Logistic回归分析

3 讨 论

本研究通过检测入组病例的血清EDN 浓度，发现与对照组相比，AR 组EDN 浓度显著升高并与外周血嗜酸性粒细胞计数及比例、血清总IgE 浓度呈正相关。此外根据SLIT 疗效分组后，有效组中EDN浓度显著低于无效组，二元Logistic 回归和ROC 曲线分析提示血清EDN 浓度具有较好的SLIT 疗效预测效能。因此，EDN 有可能在AR 的发生发展中发挥重要作用，是潜在的预测SLIT 疗效的客观生物学指标。

嗜酸性粒细胞是一种含有嗜酸性颗粒蛋白（Eosinophilic granule proteins，EGPs）的炎性细胞，其在AR的发生发展中具有重要作用。EGPs包括主要碱性蛋白、嗜酸性阳离子蛋白、嗜酸性过氧化物酶以及EDN，具有抗寄生虫和抗菌活性，参与机体免疫反应［10］。KIM H S 等［11］研究发现，特应性皮炎患者血清EDN 水平与其症状评分呈显著正相关，且在严重顽固性组的复发患者中升高，提出血清EDN 水平对复发性特应性皮炎患者具有良好的预测价值。RYCYK A 等［12］发现与胃肠道功能紊乱的婴儿相比，变应性结直肠炎患儿粪便中的EDN 水平显著增加，粪便EDN 水平的检测可鉴别食入变应原诱导的变应性结直肠炎症。然而目前尚无相关研究对EDN在变应性鼻炎患者中的表达情况进行探索。本研究通过检测研究对象的血清EDN 水平，发现与对照组相比，EDN 在变应性鼻炎患者外周血中的表达水平显著上调；而Spearman 相关性分析同样显示AR患者血清EDN 水平与疾病的VAS 评分、TNSS 评分呈显著正相关，提示EDN 可能参与AR 的发生发展，其表达水平与疾病严重程度相关。

有研究表明，AR 以Th2 型炎症反应为主，嗜酸性炎症反应为其主要组织病理特征，表现为嗜酸性粒细胞活化、增殖，并趋化聚集至鼻黏膜局部［13］。EDN 由活化的嗜酸性粒细胞合成分泌，可通过诱导树突状细胞的成熟和迁徙，增强Th2型免疫应答［14］。近年来有研究者在嗜酸性粒细胞性鼻窦炎人群血清样本发现EDN 表达水平显著上调，与疾病的活动呈显著正相关，且可诱导鼻上皮细胞生成基质金属蛋白酶-9，通过上皮-间充质转化途径调控剔出-合并-重排-简化（Elimination-combination-rearrangement-simplification，ECRS）的病理进程，参与局部嗜酸性炎症［7］。本研究通过Spearman 相关性分析，发现AR 患者血清EDN 水平与外周血总IgE 浓度和嗜酸性粒细胞计数及比例呈正相关，这一结果与既往前期研究相符，提示EDN 同样参与AR 患者的嗜酸性炎症反应，且其水平上调提示嗜酸性炎症反应加重。AIT 可通过诱导机体免疫耐受，治疗或减轻AR临床症状，是目前唯一可改变AR 疾病进程的治疗手段。其中，SLIT 相对无创、耐受性好［15］，但整体疗效尚不明确，因此，预测SLIT 疗效的可靠生物学指标亟待探索。AN J 等［16］研究发现，与外周血嗜酸性粒细胞计数相比，EDN 可较可靠地反应变应性哮喘患者的疾病控制状态，且可以预测哮喘患者对美泊利单抗的治疗反应［17］。近期RUTTEN B等［18］对EDN的稳定性进行分析，发现其不受吸烟以及昼夜节律影响，且在样本离体后可稳定存在，-80 ℃环境下可保存1 年，是一种稳定的生物标志物。而本研究利用ROC 曲线对患者血清EDN 水平和SLIT 疗效进行评价，发现EDN 可有效预测其疗效。因此，结合既往研究结果，本研究初步认为血清EDN 参与AR 的免疫应答反应，其浓度可反应AR 患者嗜酸性炎性反应程度，并可较好地预测SLIT 对于AR 患者的疗效，且离体后可在一定时间内稳定存在，具有成为SLIT疗效预测的生物标记物的潜力。

综上所述，在AR 患者血清中可有EDN 浓度的增加，且增加程度和患者症状严重程度以及外周血嗜酸性粒细胞计数、血清总IgE 浓度呈正相关。血清EDN 水平的检测具有诊断AR 以及预测AR 患者对SLIT 反应的生物学潜在价值。但本研究样本量小，随访时长尚显不足，且未对EDN 在AR 中的作用机制进行深入探索，研究结论尚待远期大样本多中心研究加以验证。