基于网络药理学和分子对接技术研究裸花紫珠化学成分抗感染的作用机制

刘晓轩，李亚梅，肖 邦，杨建琼，金洪光，黄 浩，李林福，刘 海

（1. 赣南医学院2021级硕士研究生；2. 赣南医学院2019级硕士研究生；3. 赣南医学院第一附属医院临床医学研究中心，江西 赣州 341000；4. 九江学院，江西 九江 332000；5. 赣南医学院药学院 国家中药现代化工程技术研究中心-客家中医药资源研究分中心，江西 赣州 341000）

感染通常是指细菌、病毒、真菌等病原体侵入人体所引起的局部组织或全身性反应。主要表现为白细胞增多、贫血、弥漫性血管内凝血（Disseminated intravascular coagulation， DIC）、发热等症状。老人、儿童及免疫功能低下者治疗不及时可能发展为败血症或休克，危及生命。自20 世纪20 年代青霉素［1］被发现以来，抗生素成为对抗感染的主要治疗方法，拯救了数以万计的生命，被认为是20 世纪最伟大发现之一［2］。抗生素通过干扰病原微生物细胞壁、蛋白质及遗传物质的合成发挥抗感染作用，作用单一且易产生耐药性。而中药具有多靶点、多通路、多机制的特点，近年来在抗感染治疗的研究中受到广泛关注［3］。

裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. et Arn.）为马鞭草科紫珠属植物，主要分布于我国长江流域以南，在江西、福建、广东、广西、海南等地均有生长［4-5］。属于海南大宗性地道药材，是黎族医师常用的药材之一［6］。裸花紫珠是一种多年生常绿灌木，全年均可采收，以其干燥或带嫩枝的叶入药，具有止血凝血、消炎镇痛、解毒抗菌等作用［7-10］。裸花紫珠化学成分主要包括黄酮类、苯乙醇苷类、萜类、挥发油和酚类等，本课题组前期研究获得15个裸花紫珠抗菌活性成分［11］分别为：梓醇（Catalpol）、原儿茶酸（Protocatechuic acid）、原儿茶醛（3，4-Dihydroxybenzaldehyde）、咖啡酸（Caffeic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、毛蕊花糖苷（Acteoside）、木犀草苷（Cynaroside）、异毛蕊花糖苷（Isoacteoside）、2'-乙酰基金石蚕苷（Brandioside）、2'-乙酰基毛蕊花糖苷（2'-Acetylacteoside）、木犀草素（Luteolin）、槲皮素（Quercetin）、芹菜素（Apigenin）、异鼠李素（Isorhamnetin）、5，4'-二羟基-3，7，3'-三甲氧基黄酮（5，4-Dihydroxy-3'，7'，3'-trimethoxyflavone）。但裸花紫珠抗菌成分发挥抗感染作用的具体靶点及通路尚不明确，作用机制有待阐明。

网络药理学具有与中药作用类似特点，可以系统展示多靶点、多通路的网络架构，通过数据分析实现药物与疾病相互作用的可视化［12］，近年来已经成为研究中药药效基础及药效分子作用机制的一种有效方法［13］。网络药理学可使大量成分靶点更加系统精确定位，避免了以往研究方法的局限性［14］。网络药理学将药物-基因-疾病等模块关联，以高通量方式从众多靶点、通路中筛选出相关信息，证实药物的作用机制及阐明化合物之间的协同作用［15］，但网络药理学预测结果需要验证。分子对接技术可以在分子水平上预测活性成分与靶点结合模式，增加结果可信性，从而对药物活性成分进行辅助筛选［16］。笔者以本课题组前期研究获得的15 个裸花紫珠抗菌活性成分为研究对象，采用网络药理学方法对其抗感染作用的相关靶点和通路进行分析和筛选，获取核心作用靶点，而后采用分子对接技术对其进一步验证，以探究裸花紫珠发挥抗感染作用的可能或潜在机制。

1 资料与方法

1.1 数据库及软件本研究使用的数据库及软件的功能介绍如表1所示。

表1 数据库及软件总汇

1.2 15个裸花紫珠抗菌活性成分获得根据本课题组前期对裸花紫珠抗菌作用的谱效学研究［11］，从裸花紫珠药材中获得15个抗菌活性成分，分别是梓醇、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、木犀草苷、异毛蕊花糖苷、2'-乙酰基金石蚕苷、2'-乙酰基毛蕊花糖苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、异鼠李素、5，4'-二羟基-3，7，3'-三甲氧基黄酮。在PubChem数据库中搜索各成分的smile号及CAS号。

1.3 裸花紫珠抗菌活性成分靶点收集将1.2 项中获得的smile 号及CAS 号在TCMSP 及Swiss Target Prediction数据库中检索，收集15个裸花紫珠抗菌活性成分的作用靶点，之后使用Uniprot数据库将靶点蛋白名称统一为基因名称。

1.4 感染相关靶点的筛选及交集靶点的获得以"inflection"为关键词在GeneCards 数据库中进行检索与筛选，选择相关性＞1 的靶点作为感染类疾病的相关靶点，后将其与裸花紫珠抗菌活性成分作用靶点进行交集，通过Bioinformatics & Evolutionary Genomics 网站在线制作Venn 图，获得交集靶点信息，得到裸花紫珠抗菌活性成分抗感染的潜在靶点。

1.5 蛋白互作网络（PPI）的构建及核心靶点的筛选将1.4 项中获得的交集靶点输入STRING 数据库，选择Multiple proteins 后输入已获得的交集靶点基因，选择置信区间＞0.70，其余参数保持默认设置，得到裸花紫珠抗菌成分抗感染作用的蛋白相互作用网络（Protein-protein interaction， PPI）。通过Cytoscape 3.9.0 对获得的PPI 网络进行分析和可视化处理，使用cyto Hubba 插件进行网络拓扑分析，筛选出PPI网络中药物与疾病的核心靶点。

1.6 基因本体分析（GO）与通路富集分析（KEGG）分析运用omicshare 基因数据分析网站，对上述1.4 获得的交集靶点进行GO 富集分析及KEGG通路富集分析。

1.7 构建成分-靶点-通路图将上述得到的裸花紫珠中15个抗菌活性成分、交集靶点、1.6项中富集得到的感染主要相关信号通路导入Cytscope 3.9.0中，构建“成分-靶点-通路”网络，并通过网络度值（degree值）的大小对网络进行分析。

1.8 分子对接验证先从ZINC 中下载1.7 项中degree 排名前2 的活性成分的Mol2 格式文件，再从RCSB网站下载1.7项中degree值排名前5核心靶点的PDB文件。运用Discovery studio 软件进行分子对接验证。采用libdockscore 值评估两者之间的结合能力，若 libdockscore＞100，则提示对接分子能够自发进行结合，且结合稳定。

2 结 果

2.1 裸花紫珠抗菌活性成分靶点收集和交集靶点的获得15 个裸花紫珠抗菌活性成分在TCMSP 数据库及Swiss Target Prediction 数据库中收集到作用靶点共356 个。在GeneCards 数据库中进行检索与筛选，获得与感染相关性＞1的靶点2 916个。

将疾病靶点与裸花紫珠抗菌活性成分作用靶点成分取交集，制作Venn 图，得到交集靶点231 个（图1）。交集靶点可能是裸花紫珠发挥抗感染作用的基础。

图1 药物-疾病交集靶点Venn图

2.2 蛋白互作网络图的构建及核心靶点筛选将药物-疾病交集靶点导入String 网络平台分析，设置置信区间为high confidence 0.70，借助Cytscope 3.9.0，对保存的TSV 格式文件进行可视化处理（图2）。节点代表靶点蛋白，边代表蛋白质与蛋白质之间的作用关系，网络连接程度越高说明蛋白质之间关系越密切，以同心圆排列degree 值越高的蛋白节点越大，颜色越深，越趋于中心位置。通过计算得到degree 值排名前20 的靶点（表2），其中排名前5的核心靶点为：STAT3、TNF、AKT1、IL6、VEGFA。

表2 PPI网络中degree值排名前20靶点特征参数

图2 裸花紫珠中15个抗菌活性成分抗感染的PPI网络图

2.3 GO 分析及KEGG 分析通过omicshare 基因数据分析网站对药物-疾病交集靶点进行GO 富集分析和KEGG 通路分析。GO 功能富集分析共得到8 365 个GO 条目，其中包含6 750 个生物学过程（Biological Process，BP）条 目、601 个 细 胞 组 成（Cellular Component，CC）条目和1 014 个分子功能（Molecular Function，MF）条目，根据P值选择最具统计学意义数据作GO分析条状图（图3）。

图3 GO富集分析条状图

主要涉及的生物过程包括细胞代谢过程（Cellular process）、刺激反应（Response to stimulus）、代谢过程（Metabolic process）、生物调节功能（Biological regulation）、调节生物进程（Regulation of biological process）等；涉及到细胞组成包括细胞（Cell）、细胞组分（Cell part）、细胞器（Organelle）等；主要分子功能为结合（Binding）、催化活性（Catalytic activity）、分子功能调节器（Molecular function regulator）等。推测靶点基因主要是通过诱发炎症反应、调节细胞代谢、调节酶的催化、诱导细胞凋亡等过程达到抗菌效果。

KEGG 通路富集分析结果显示上述步骤筛选出的交集基因与癌症和感染通路相关性高（图4），可以证明网络药理学结果可靠。KEGG 共富集通路272 条，根据P值排序选择排名前20 的通路进行展示，其中17 个与人类疾病相关，2 个与环境因素有关，1 个与微生物有关。根据P值排序，相关性排名前5 的信号通路依次为： Pathways in cancer、Human cytomegalovirus infection、Proteoglycans in cancer、MicroRNAs in cancer、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection（图5、表3）。

表3 KEGG通路富集分析排名前20的信号通路

图4 KEGG通路富集结果

图5 KEGG通路富集分析圈图

2.4 构建成分-靶点-通路图将药材裸花紫珠中15 种抗菌活性成分、交集靶点及富集得到的信号通路导入Cytoscape 3.9.0 中构建网络图（图6）。成分-靶点-通路图中有272 个节点和1 210 条边。根据degree 值大小设置节点大小，degree 值越大节点越大。排名前5 的活性成分为：Quercetin、Luteolin、Apigenin、5，7-Dihydroxy-3'，4'，5'-trimethoxyflavone、Isorhamnetin；排 名 前5 信 号 通 路 为：Human cytomegalovirus infection、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、 Hepatitis B、 Human papillomavirus infection、 Epstein-Barr virus infection。

图6 成分-靶点-通路图

2.5 分子对接将degree 值排名前2 的化合物作为代表性药物分子与degree 值排名前5 的核心靶点（表4）进行分子对接验证实验结果如表5所示，木犀草 素（Luteolin）和 槲 皮 素（Quercentin）与STAT3、TNF、AKT1、IL-6、VEGFA 的libdockscore 均＞100，木犀草素-AKT1，槲皮素-STAT3 有更高的libdockscore值，说明本课题组前期筛选出的裸花紫珠抗菌活性成分可靠，且AKT1 与STAT3 可能为发挥抗感染作用的主要靶点。对配体-受体复合物进行可视化展示可以得到药物小分子木犀草素和槲皮素，能够分别稳定对接到蛋白AKT1、STAT3 的活性口袋中，对接2D 结构示意图（图7、图8）显示药物小分子与靶点蛋白结合主要为氢键和Π 键，Π 键主要包括烷基-Π 键（Pi-alkyl）、阴离子-Π 键（Pi-cation）、阳离子-Π键（Pi-anion），除此之外盐桥、范德华力和碳氢键等也在某些分子结合中发挥作用。分子对接2D 结果显示，药物小分子木犀草素与靶点蛋白AKT1 中的ASP、THR、PRO、MET、HIS 等氨基酸残基结合；药物小分子槲皮素与靶点蛋白STAT3 中的ARG、LYS、ASN、HIS、SER等氨基酸残基结合。

图7 木犀草素-AKT1 分子对接结果及结合方式

图8 槲皮素-STAT3分子对接结果及结合方式

表4 degree值排名前5的核心靶点蛋白RCSB号

表5 分子对接Libdockscore值

3 讨 论

感染一般是由病原微生物侵入人体导致，表现为局部血流量增加、组织液渗出、白细胞聚集增多等，与“炎症”表现相似［17-19］。张静怡等［20］研究发现，止痒皮肤液因含有抗炎抗菌成分对皮疹有更好的治疗效果，裸花紫珠不仅可以抗菌还具有消炎、解毒等作用［21］，因此对于感染类疾病的治疗可能具有更加优越的治疗效果。

通过PPI 网络图得到degree 值排名前5 的核心靶点为STAT3、TNF、AKT1、IL6、VEGFA。孙云等［22］研究发现，IL6、STAT3 与孕妇B 族链球菌感染有关；雷声云等［23］研究发现，女性人乳头瘤病毒感染与STAT3 相关。STRANGFELD A 等［24］通过免疫和临床研究发现，TNF 在防御细菌感染中起到非常关键的作用，使用TNF 抑制剂治疗的患者具有更高的细菌易感性。此外，俞晓进等［25］通过建立小鼠动物模型证实，多种细菌可以诱导机体产生TNF，TNF主要通过调节免疫系统和改善代谢来抵御细菌侵袭，证明TNF 在抗菌感染中发挥重要作用。ZHAO J 等［26］研究发现，TNF、AKT1、IL6 为清肺排毒汤治疗新冠肺炎的关键分子。GUAN J等［27］研究发现，在大肠杆菌、肺炎克雷伯菌感染时IL-6表达上调，治疗后IL-6表达下降。SHEN X 等［28］通过网络药理学方法筛选地榆抗幽门螺杆菌得出AKT1、VEGFA 等为核心靶点。LIU G 等［29］研究发现，蛋白激酶（AKT1）在细菌感染时被下调，在急性炎症性肺损伤和金黄色葡萄球菌感染小鼠模型中，AKT1 缺乏导致严重的疾病进展，伴随着中性粒细胞的募集和杀菌活性的增强。YANG R 等［30］研究发现，VEGFA 可以通过调节TLR2-MAPK-ERK1/2 信号通路参与脑膜炎大肠杆菌诱导的血脑屏障破坏，表明VEGFA为预防临床大肠杆菌脑膜炎的基本靶标。由此可知，本文筛选出的前5 个核心靶点STAT3、TNF、AKT1、IL6、VEGFA均参与炎症反应和调节免疫应答，表明裸花紫珠中抗菌活性成分可能是通过作用于多个靶点发挥抗感染作用。

最后通过分子对接技术对网络药理学结果进行验证，结果表明，祼花紫珠抗菌活性代表性成分木犀草素、槲皮素与核心靶点中degree 值排名前5的基因对接结果良好，其中AKT1、STAT3 具有更高的结合趋势。

4 结 论

综上所述，通过网络药理学对15 个裸花紫珠抗菌活性成分靶点进行筛选，而后选择核心靶点degree 值排名前5 的靶点STAT3、TNF、AKT1、IL6、VEGFA 分别与代表性药物进行分子对接，对接结果均良好，其中AKT1、STAT3 具有更高的libdockscore值，表明AKT1、STAT3 可能为裸花紫珠发挥抗感染作用的关键靶点。推测裸花紫珠抗菌活性成分主要通过调控细胞代谢和人体免疫应答发挥抗感染作用。本研究可为后续裸花紫珠抗感染作用机制的深入研究指明方向。