三七生药粉乙醇灭菌工艺优化及不同灭菌方式对质量的影响△

崔琳琳，陈宁，曹玲，孙艳，杜崇民，金宗元，张育龙，李晨鹏，高艳红*

1.鲁南制药集团股份有限公司 中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006；

2.鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006；

3.青岛市即墨区中医医院，山东 青岛 266200

三七为五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen 的干燥根和根茎，具有散瘀止痛、消肿定痛的功效，临床上主要用于治疗咯血、吐血、跌扑肿痛等[1]。很多中成药，如三七片、三七伤药片/胶囊等含有的三七需要直接打粉入药，中药打粉入药往往携带大量的微生物[2-3]。因此，生药粉入药前需要进行灭菌处理，使其微生物含量在《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版的限定范围之内。目前，对三七灭菌工艺的研究大多为辐照灭菌[4-6]，虽然辐照灭菌效果理想，但其辐照剂量超标对身体产生的安全性问题一直存在争议，消费者对经过辐照灭菌的产品存有安全疑虑[7-8]。张海江等[9]采用75%乙醇对三七进行灭菌，能很好地达到灭菌效果，但未对其他灭菌方式进行研究。

本研究以三七生药粉为研究对象，以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1含量，皂苷总量和灭菌率的综合评分为指标，采用响应面法优选三七乙醇灭菌工艺，同时与常规灭菌方法进行质量对比研究，对乙醇灭菌技术的优势进行探讨，为后续制剂开发及研究提供参考。

1 材料

2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；XS105DU 型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；GZX-9240MBE 型电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；MQS0.6 型脉动真空灭菌柜（张家港市环宇制药设备有限公司）。

三七（安国市聚药堂药业有限公司，批号：2110009），经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen 的干燥根和根茎；对照品人参皂苷Rg1（批号：110703-202034，纯度：94.0%）、人参皂苷Rb1（批号：110704-202129，纯度：96.0%）、三七皂苷R1（批号：110745-201820，纯度：90.4%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均购自美国天地有限公司；磷酸（纯度≥85.0%）、乙醇均购自南京化学试剂有限公司；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 三七生药粉灭菌方法

2.1.1三七生药粉制备 取三七，粉碎过四号筛，备用。

2.1.2灭菌样品的制备 称取三七生药粉200 g，采用乙醇灭菌、湿热灭菌、辐照灭菌、干热灭菌方法制备三七生药粉的灭菌样品。湿热灭菌：脉动真空灭菌柜115 ℃灭菌30 min，置于鼓风干燥机中，70 ℃下干燥3～4 h；干热灭菌：烘箱160～170 ℃灭菌150 min；辐照灭菌：60Co 射线6 kGy 辐照灭菌；乙醇灭菌：75%乙醇浸润，密闭3 h，放入鼓风干燥箱中，70 ℃下干燥3～4 h。

2.2 含量测定

2.2.1色谱条件Welch Ultimate®PG-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（B）-水（A）梯度洗脱（0～12 min，19%B；12～60 min，19%～36%B）；柱温为30 ℃；检测波长为203 nm；流速为1.0 mL·min-1；进样量为10 μL。

2.2.2对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷 Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.088 04、0.125 40、0.130 40 mg·mL-1的混合对照品溶液，即得。

2.2.3供试品溶液的制备 参照《中国药典》2020年版（一部）“三七”含量测定项下方法制备供试品溶液。

2.2.4线性关系考察 分别取2.2.2项下对照品溶液，三七皂苷R1质量浓度分别为0.088 0、0.176 1、0.440 2、0.880 5、1.320 6、1.760 8 mg·mL-1，人参皂苷Rg1质量浓度分别为0.152 4、0.304 8、0.762 0、1.524 0、2.286 1、3.048 2 mg·mL-1，人参皂苷Rb1质量浓度分别为0.130 4、0.260 8、0.652 3、1.304 2、1.956 8、2.608 1 mg·mL-1，注入液相色谱仪，按2.2.1项下色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标（Y）、含量为横坐标（X）绘制标准曲线，得人参皂苷Rg1回归方程：Y=362 605X-5 805.6（r=0.999 8），人参皂苷Rb1回归方程：Y=267 371X-4 729.1（r=0.999 4），三七皂苷R1回归方程：Y=134 980.96X+6 110.72（r=0.999 2）。结果表明，人参皂苷Rg1在0.152 40～3.048 10 μg 线性关系良好，人参皂苷Rb1在0.130 40～2.608 20 μg 线性关系良好，三七皂苷R1在0.088 04～1.760 80 μg线性关系良好。

2.3 灭菌率测定

采用平板计数法对制备的样品菌总数进行测定，该法出自《中国药典》2020 年版（四部）1105 通则项下的非无菌产品微生物限度检测法，按公式（1）、（2）计算灭菌率[10]。

2.4 层次分析法（AHP）确定权重系数

根据《中国药典》2020年版对三七含量测定成分要求，对三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量，三者皂苷总含量和灭菌率权重指标予以量化。将5个指标分为2个层次，确定5项指标的顺序为皂苷总含量=灭菌率＞三七皂苷R1=人参皂苷Rg1=人参皂苷Rb1。构建的指标成对比较的判断优先矩阵见表1。根据评分结果，AHP法计算得到三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三者皂苷总含量和灭菌率的权重系数分别为0.11、0.11、0.11、0.33、0.33，一致性比例因子（CR）=0＜0.1，指标优先比较判断矩阵具有较好的一致性，权重系数有效。

表1 三七灭菌工艺权重层次分析指标成对比较的优先矩阵

2.5 乙醇灭菌工艺单因素试验

2.5.1乙醇体积分数对综合指标的影响 在乙醇用量25%、干燥温度65 ℃、灭菌时间2 h 条件下，考察不同乙醇体积分数（45%、55%、65%、75%、85%、95%）对综合评分的影响，结果见图1。随着乙醇体积分数的增加，综合评分先增加后下降，其中乙醇用量对三七中皂苷含量影响较小，对灭菌率的影响较大，在乙醇体积分数75%条件下，灭菌率最高，因此选择65%、75%、85% 乙醇做后续实验。

图1 乙醇体积分数对三七灭菌工艺综合评分的影响（,n=6）

2.5.2乙醇用量对综合指标的影响 在乙醇体积分数75%、干燥温度65 ℃、灭菌时间2 h 条件下，考察不同乙醇用量（15%、20%、25%、30%、35%、40%）对综合评分的影响，结果见图2。随着乙醇用量的增加，综合评分先增加后缓慢下降，其中乙醇用量＞30%时，三七中皂苷含量出现降低趋势，在乙醇用量25%条件下，灭菌率最高，随着乙醇用量的增加，灭菌率基本不变，因此选择20%、25%、30%的乙醇用量做后续实验。

图2 乙醇用量对三七灭菌工艺综合评分的影响（,n=6）

2.5.3灭菌时间对综合指标的影响 在乙醇体积分数75%、乙醇用量25%、干燥温度65 ℃条件下，考察灭菌时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对综合评分的影响，结果见图3。随着灭菌时间的增加，综合评分先增加后趋于平缓，在2 h之前灭菌率随着灭菌时间的增加而增加，2 h时灭菌率最高，2 h之后灭菌率基本不变，因此选择1.5、2.0、2.5 h做后续实验。

图3 灭菌时间对三七灭菌工艺综合评分的影响（,n=6）

2.5.4干燥温度对综合指标的影响 在乙醇体积分数75%、乙醇用量25%、灭菌时间2 h条件下，考察不同干燥温度（45、55、65、75、85、95 ℃）对综合评分的影响，结果见图4。当干燥温度低于85 ℃时，综合评分变化不大，对皂苷含量和灭菌率的影响均较小，当干燥温度＞85 ℃时，三七中皂苷的含量显著下降，考虑到时间、成本等因素，因此选择65、75、85 ℃做后续实验。

图4 干燥温度对三七灭菌工艺综合评分的影响（,n=6）

2.6 响应面法优化乙醇灭菌工艺

2.6.1方案设计及试验结果 依据响应面试验设计原理，结合单因素试验结果，进行因素水平设计与试验。因素水平见表2，设计及结果见表3～4。

表2 三七乙醇灭菌工艺响应面因素水平

表3 三七乙醇灭菌工艺响应面试验设计及结果分析

2.6.2方差分析和拟合回归方程 利用Design-Expert 8.0.6 软件进行二次多元回归分析，响应值与各因素的回归方程：Y=36.100-0.081A+0.037B+0.170C-0.076D-0.040AB-0.130AC+0.033AD+0.200BC+0.120BD-0.017CD-0.420A2-0.150B2-0.480C2-0.330D2，方差分析结果见表4。模型的F值为40.19、P值＜0.000 1，说明模型极显著；失拟项P值为0.134 2，说明非试验因素对试验结果影响不大，模型成立。其中灭菌时间对综合评分有极显著影响，乙醇体积分数和干燥温度对综合评分影响差异有统计学意义，乙醇用量对综合评分影响差异无统计学意义，二次项A2、B2、C2、D2均达到极显著水平（P＜0.001）。各因素的影响顺序为灭菌时间＞乙醇体积分数＞干燥温度＞乙醇用量，交互作用的响应面和等高线图见图5～10。

图5 乙醇体积分数和乙醇用量对三七灭菌工艺综合评分的影响

表4 三七灭菌工艺响应面回归模型方差分析

2.6.3验证实验 根据响应面模型和结果分析，得到三七粉最佳灭菌工艺为乙醇体积分数73.50%、乙醇用量26.47%、灭菌时间2.13 h、干燥温度74.39 ℃，在此灭菌条件下综合评分为36.137 3分。结合实际生产及可操作性，将灭菌条件调整为乙醇体积分数74%、乙醇用量26%、灭菌时间2.2 h，干燥温度75 ℃，在此条件下进行3次验证实验，结果见表5。

由表5 可知，3 次验证实验平均综合评分为36.19 分，RSD 为0.161%，表明该工艺稳定可行、重复性好，可作为三七灭菌工艺。

表5 三七灭菌工艺响应面平行验证实验结果

2.7 不同灭菌方式对三七质量的影响

2.7.1微生物限度对比 按 《中国药典》2020 年版（四部）通则 1108 中药饮片微生物限度检查法进行实验，结果显示，需氧菌、霉菌和酵母菌总数均小于10 CFU·g-1，大肠埃希氏菌和活螨未检出，各灭菌样品均达到预期灭菌效果。

2.7.2《中国药典》2020年版各自检查结果对比 按《中国药典》2020年版（一部）三七项下各项检查要求，对灭菌前后三七鉴别项、水分、总灰分、酸不溶灰分、浸出物、含量测定进行检测，结果见表6。湿热灭菌后，三七中皂苷的含量降低，总质量分数＜5.0%，已不符合《中国药典》2020年版标准。干热灭菌后，三七中皂苷的含量也出现一定程度的减少，乙醇灭菌与辐照灭菌对含量影响较小。除含量测定外，其余各项检测结果均符合《中国药典》2020 年版规定。

表6 三七不同灭菌方法样品的《中国药典》2020年版检测结果

2.7.3指纹图谱对比 精密称取上述各样品0.6 g，加入甲醇50 mL，放置过夜，置80 ℃水浴提取2 h，放冷，取续滤液，0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脱（0～15 min，21%B；15～20 min，21%～22%B；20～28 min，22%～32%B；28～42 min，32%～38%B；42～65 min，38%～85%B；65～75 min，85%～100%B）；检测波长203 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min-1；进样量为10 μL，结果见图11，相似度结果见表7。乙醇灭菌、辐照灭菌和干热灭菌指纹图谱与未灭菌指纹图谱的相似度均大于0.99，湿热灭菌指纹图谱与未灭菌指纹图谱的相似度均小于0.99。

表7 三七不同灭菌方法样品的指纹图谱相似度

图6 乙醇体积分数和灭菌时间对三七灭菌工艺综合评分的影响

图7 乙醇体积分数和干燥温度对三七灭菌工艺综合评分的影响

图8 乙醇用量和灭菌时间对三七灭菌工艺综合评分的影响

图9 乙醇用量和干燥温度对三七灭菌工艺综合评分的影响

图10 灭菌时间和干燥温度对三七灭菌工艺综合评分的影响

图11 三七不同灭菌方法样品的指纹图谱

3 讨论

中药直接打粉入药的灭菌一直是中成药生产过程中不可或缺的一个环节。由于中药的生长、采收和制备的特殊性，大多数的中药原料药都不同程度地带有一些细菌、霉菌或其他致病菌[11]。目前常规灭菌方法有湿热灭菌、干热灭菌、辐照灭菌、乙醇灭菌、微波灭菌、紫外灭菌等，选用适当的灭菌方法，保证灭菌后的中药生药粉内在质量的同时，又能满足微生物限度的要求[2]。因此，本研究通过对比4 种不同灭菌方法，对灭菌前后样品进行检测，结果显示4 种灭菌方法鉴别、水分、总灰分、酸不溶灰分、浸出物和微生物限度均符合《中国药典》2020 年版规定，但是湿热灭菌后三七中皂苷含量显著下降，已低于《中国药典》2020 年版标准，且与生药材相比指纹图谱相似度最低，说明三七不适合湿热灭菌，这与王影等[12]的研究结果一致。干热灭菌同样也会引起皂苷含量的降低。乙醇灭菌与辐照灭菌对皂苷成分影响较小，与生药材相比指纹图谱相似度较高，但是辐照灭菌存在残留问题且生产成本较高，而乙醇灭菌法在较短时间内就能把微生物杀灭，且对三七质量没有影响，具有灭菌效果可靠、工艺设备简单、操作方便、生产成本较低等优势，在实际大生产中是一种常用、经济的灭菌手段，可以作为三七生药粉的灭菌方法。

本研究在单因素的基础上，采用响应面法优化三七乙醇灭菌工艺。结果显示，最佳灭菌工艺为乙醇体积分数74%、乙醇用量26%、灭菌时间2.2 h、干燥温度75 ℃，在此灭菌条件下综合评分为36.19分。在此条件下不仅提高了灭菌率，也更大程度保证了三七皂苷类成分不被破坏，保证了灭菌后三七的质量，为三七直接打粉入药的灭菌工艺应用奠定实验基础，可为三七后续制剂的开发利用提供参考。