不同品种来源枸杞子多糖及甜菜碱含量测定和比较分析△

胡颖，徐鑫，a，张春阳，刘赛，徐常青，王占林，朱金忠，敖冬梅*，徐荣，4*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；

2.北京城市学院，北京 100093；

3.宁夏中宁县杞鑫枸杞种业有限公司，宁夏 中卫 755100；

4.中国中药协会 药食同源物质评价和利用专业委员会，北京 100061

枸杞子在中国的药用和食用历史已有2000 多年，现存最早药学专著《神农本草经》中对其有“久服轻身不老”的评价[1]。我国传统中医药广泛应用的枸杞属植物为多年生落叶灌木，主要有宁夏枸杞Lycium barbarumL.和中华枸杞L.chinenseMill（仅以根入药）。宁夏枸杞的果实为中药枸杞子的唯一来源，主要分布于我国宁夏、内蒙古、青海、甘肃等干旱、半干旱地带[1]。目前我国大部分的枸杞子栽培品种都来自宁夏地区培育的宁杞系列品种[2]。随着宁杞系列品种的增加，需要对其进行全面比较，找到适宜不同用途的优良品种。由于枸杞子果实陆续成熟，采收时间不同可能影响其成分的含量[3]。随着科学技术的不断进步，枸杞子的加工方法除了传统晾晒法，烘干、微波、冻干等方法也开始不断应用于枸杞子的产地加工。因此，不同品种枸杞适宜的采收期和加工方法同样值得关注。

枸杞子除了作为传统饮片，还是经典方剂杞菊地黄丸、山东阿胶膏、定坤丹等的主要组分。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版中收录的以枸杞子作为主要组分的方剂有近80 种[4]。近年来，随着保健行业蓬勃发展及人民健康观念的日益提高，枸杞子因其较高的营养价值和显著的药用功效、保健作用更加受到重视[5]，成为原卫生部最早颁布的药食同源品种之一。还可将枸杞子泡在酒里制作成药酒或者泡在茶里饮用，具有养肝明目、降血糖、抗疲劳等作用[7]。总之，枸杞子作为药食同源中药越来越受到青睐，已成为大多数人所认可的高质量营养保健品。多糖和甜菜碱是枸杞子的主要有效成分，并且作为《中国药典》2020年版规定的含量测定项[6]，具有广泛的药理作用。多糖及甜菜碱含量是评价枸杞子质量的重要指标之一，对于枸杞子药食同源的产品开发具有重要作用。因此，本研究比较分析了宁夏地区种植的不同品种枸杞子在2 种采收时间、加工方式下多糖及甜菜碱含量的变化。研究结果可为药食同源品种筛选及适宜采收期和加工方式的选择提供参考，同时可用于指导枸杞子质量控制和不同品种枸杞子的合理采收及产地加工。

1 材料

1.1 试药

无水葡萄糖标准品（批号：S21J12Ⅰ138537，纯度：98.0%）、对照品甜菜碱（批号：ML210215-03，纯度：99.2%）均购于中国食品药品检定研究院；甜菜碱含量检测试剂盒（北京索莱宝生物技术有限公司，试剂盒中的试剂一为提取液、试剂二为乙醚、试剂三为丙酮、试剂四为活性炭）；苯酚、浓硫酸、石油醚、无水乙醇、无水甲醇、盐酸、乙醚（北京化工厂，分析纯）；水为纯净水。

枸杞子样品均于2021年购自宁夏中宁县杞鑫种业有限公司，经中国医学科学院药用植物研究所徐常青研究员鉴定为宁夏枸杞Lycium barbarumL.。具体品种、加工方式、采收时间见表1。其中自然晾晒干燥的枸杞子样品晾晒于宁夏杞鑫种业有限公司（位于宁夏中宁县），晾晒时间约为7 d，白天温度为30～40 ℃，夜间温度为20～30 ℃。烘干的枸杞子样品进行鼓风梯度干燥，第一阶段35～45 ℃，第二阶段50～55 ℃，第三阶段55～60 ℃，烘干时间约为48 h。

表1 枸杞子品种、加工方式、采收时间

1.2 仪器

TD5A 型台式低速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；BL6-180C 型超声波清洗仪（北京佩莱生物技术有限公司）；DHG-9123A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；M1000型酶标仪（帝肯实验器材有限公司）；BJ-150 型粉碎机（慈溪市豪迈电器有限公司）；JOANLAB 型水浴锅（金坛市晶玻实验仪器设备厂）；十万分之一分析天平（Mettler-Toledo公司）；Research plus型Eppendorf移液枪（艾本德中国有限公司）。

2 方法

2.1 多糖的含量测定

2.1.1对照品溶液制备 精密称取无水葡萄糖标准品10 mg，加入适量水溶解，置于100 mL 量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.1 mg·mL-1葡萄糖对照品溶液[3]。

2.1.2标准曲线绘制 精确量取葡萄糖对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别至于具塞试管中，加入蒸馏水至2.0 mL。再加入5%苯酚试剂1 mL摇匀，再加入浓硫酸5 mL，摇匀，放置10 min后，置40 ℃水温水浴中15 min，取出后迅速冷却至室温[8]。并使用酶标仪在490 nm 波长处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程：Y=5.288 7X+0.104 9（r=0.995 3）。

2.1.3供试品溶液制备 随机抽取1 组样品，每份称取100 mg，共9 份，置于离心管中。先加入石油醚5 mL，脱脂30 min，重复2 次，滤过，阴凉处挥去石油醚[9]。后加入95%乙醇5 mL，在65 ℃下超声30 min，重复2次，置于80 ℃的水浴锅中挥干[9]，按L9（34）正交设计进行超声提取，因素水平见表2。5000 r·min-1离心10 min（离心半径为16 cm），分离上清液，所得滤渣重复上述操作。将2次所得上清液合并，滤过，定容至25 mL，吸取上述溶液1 mL定容至10 mL，得到对照品溶液。取待测多糖溶液1.0 mL于干净试管中，按2.1.2项下方法处理后，在490 nm波长处测定吸光度值[9]，计算葡萄糖质量浓度，并根据公式（1）计算样品中多糖的含量。根据正交设计结果确定最佳提取工艺[9]。

表2 枸杞中多糖提取工艺的L9（34）因素水平

式中C为葡萄糖的质量浓度，D为样品稀释倍数，V为样品溶液总体积，m为样品总质量，f为校正因子。

2.1.4样品测定方法 根据2.1.2、2.1.3项下方法测定样品枸杞子中多糖含量。

2.1.5重复性试验 同一供试品溶液，测定6 份平行样品中的多糖含量，计算多糖含量平均值和RSD，确定该方法重复性是否良好。

2.1.6稳定性试验 同一供试品溶液，在180 min内每隔30 min测定1次吸光度值，考察其稳定性。

2.1.7精密度试验 同一供试品溶液重复测定6次，测得吸光度值，计算RSD[10]，考察其精密度。

2.1.8加样回收率试验 精密称取已知含量的枸杞子样品9 份，分别加入相应对照品溶液，按2.1.2、

2.1.3项下方法，测定吸光度值，计算加样回收率和RSD。

2.2 枸杞子中甜菜碱含量测定

2.2.1样品测定方法 使用甜菜碱检测试剂盒对枸杞子样品进行甜菜碱含量的测定。测定原理为甜菜碱在强酸条件下和硫氰酸铬铵（雷氏盐）发生反应产生沉淀，沉淀用丙酮溶解形成红色溶液，在525 nm 处有特征吸收峰，测定525 nm处的吸光度值，可计算样品中甜菜碱含量。按照试剂盒操作说明，取枸杞子样品200 mg 加入提取液1 mL（80%甲醇），提取温度60 ℃、提取时间30 min进行超声提取。加入试剂四后充分振荡，离心后取上清液，在约70 ℃的金属浴上挥至约0.2 mL，蒸馏水定容至1 mL。配制成质量浓度为10 mg·mL-1的甜菜碱对照品溶液，依次稀释成质量浓度分别为9、8、7、6、5、4、3、2 mg·mL-1的对照品系列溶液，以甜菜碱质量浓度为横坐标（X），吸光度值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.059 1X-0.127 8（r=0.995 4）。

在供试品溶液、对照品溶液、空白溶液（蒸馏水）试管中分别加入配制好的试剂一（雷氏盐，临用前配制，加入蒸馏水15 mL，用浓硫酸调节pH为1，搅拌45 min，滤过后定容至20 mL），充分混匀后冷藏于4 ℃中反应120 min，离心后弃去上清液；再分别加入试剂二0.3 mL，离心后弃去上清液，通风橱内挥发干净后加入试剂三0.3 mL。点样于96 孔板后，使用酶标仪在525 nm 波长处进行测定。

2.2.2重复性试验 同一供试品溶液，测定6 份平行样品中的甜菜碱含量，计算甜菜碱含量平均值和RSD，确定该方法准确性是否良好。

2.2.3稳定性试验 同一供试品溶液，在180 min内每隔30 min测定1次吸光度值，考察其稳定性。

2.2.4精密度试验 同一供试品溶液重复测定6次，测得吸光度值，计算RSD[10]，考察其精密度。

2.2.5加样回收率试验 精密称取已知含量的枸杞子样品9份，分别加入相应对照品溶液，按2.2.1项下方法测定，测定吸光度值，计算加样回收率和RSD。

2.3 数据处理

利用Microsoft Office Excel 2003 进行数据分析，再用SPSS 26.0 进行数据方差分析，对测得的枸杞子中多糖和甜菜碱含量数据进行多重比较。

3 结果与分析

3.1 多糖供试品溶液提取工艺考察结果

按照提取温度、提取时间、料液比L9（34）正交设计方案进行提取，以多糖含量为评价指标，优化多糖供试品溶液制备方法（表3～4）。

表3 枸杞子中多糖超声提取工艺正交试验方案

表4 枸杞子中多糖提取工艺正交试验方差分析

由正交试验结果的极差分析可知，三因素对多糖质量分数的影响程度为料液比＞提取温度＞提取时间，其最佳组合为A2B1C3。

结合极差分析，综合考虑实际提取情况，最佳组合仍然与极差分析结果一致为A2B1C3，即以提取温度65 ℃、提取时间40 min、料液比1∶60。

3.2 多糖供试品溶液制备方法学考察结果

3.2.1精密度试验 测得的吸光度值RSD 为0.15%，表明仪器的精密度良好。

3.2.2稳定性试验 结果所示，供试品溶液在180 min 内吸光度值无明显变化，RSD 为0.08%，表明溶液在180 min 内稳定性良好。

3.2.3重复性试验 同一批枸杞子样品的RSD 为0.14%，表明方法重复性良好。

3.2.4加样回收率试验 结果见表5。

表5 枸杞子中多糖加样回收率试验结果

3.3 2种采收期不同品种的枸杞子中多糖含量比较

由图1 可知，不同采收时间不同品种之间的多糖含量均存在差异，但规律不同，仅“宁杞10 号”品种2 个采收时间的多糖含量P为0.037，差异有统计学意义，均为6 月20 日多糖含量更高，因此这个品种的采收时间宜选择6 月份，避免因为采收时间不当导致多糖含量降低，影响药效。而“宁杞1 号”“宁杞4 号”“宁杞5 号”“宁杞7 号”则是以7 月20日样品中多糖含量较高，但差异无统计学意义，可以根据实际情况选择采收时间。造成大多数品种以7 月20 日采收的多糖含量更高的原因，可能是7 月20 日在大暑节气前后，这个时段日照时间长、降雨多，因而枸杞子中多糖含量相对较高。

图1 2种采收期不同品种枸杞子的多糖质量分数比较（,n=5）

7 月20 日采集的不同品种的枸杞子多糖含量差异有统计学意义，其中“宁杞5 号”多糖含量最高，“宁杞10 号”多糖含量最低，与“宁杞4 号”“宁杞7 号”“宁杞5 号”差异有统计学意义。6 月20 日采集的不同品种的枸杞子多糖含量差异无统计学意义，因此未进行讨论。

3.4 2 种加工方式下不同品种枸杞子多糖含量的差异比较

由图2 可知，不同加工方式的枸杞子的多糖含量具有一定的差异，这与相关报道的干燥方式、干燥温度及干燥时间对多糖含量变化影响显著的研究结果基本一致[10-12]。其中，“宁杞1 号”“宁杞4 号”“宁杞5 号”不同加工方式的多糖含量差异相对较大，且都是以烘干方式的多糖含量较高。而“宁杞7 号”“宁杞0909 号”和“宁杞10 号”的不同加工方式的多糖含量以晒干的较多。但经过SPSS 26.0数据比较后发现只有“宁杞1 号”和“宁杞4 号”的2 种加工方式多糖含量差异比较的P值分别为0.047 和0，差异有统计学意义，因此“宁杞1 号”“宁杞4 号”和“宁杞5 号”宜选用烘干方式，其他品种可以根据实际情况选择加工方式。造成该差异的原因可能是不同加工方式的枸杞子采用自然晾晒方式得到的样品的加工时间为7 d，干燥速度较慢、时间较长，而采用烘干方式得到的样品的加工时间为3 d，干燥速度较快，导致多糖转化为其他单糖或其他成分的时间较少，因此多糖含量更高。

图2 2种加工方式不同品种的枸杞子多糖的质量分数比较（,n=5）

烘干方式加工不同品种的枸杞子多糖含量差异有统计学意义，其中“宁杞4 号”多糖含量最高，“宁杞10号”多糖含量最低，且这2个品种的枸杞子均与其他品种差异有统计学意义。晒干方式加工不同品种的枸杞子多糖含量差异无统计学意义，因此未进行讨论。

3.5 甜菜碱供试品溶液制备方法学考察结果

3.5.1精密度试验 测得的吸光度值RSD 为0.23%，表明仪器的精密度良好。

3.5.2稳定性试验 样品溶液在180 min 内吸光度值无变化，RSD为0.13%，表明溶液在180 min内稳定性良好。

3.5.3重复性试验 同一批枸杞子样品的RSD 为0.21%，表明方法重复性良好。

3.5.4加样回收率试验 甜菜碱的加样回收率为98.73%～102.71%，平均回收率为 100.60%，RSD为1.53%，见表6。

表6 甜菜碱加样回收率试验结果

3.6 2 个采收期不同品种枸杞子甜菜碱含量的差异比较分析

由图3 可知，不同采收期的枸杞子甜菜碱含量具有一定差异，其中“宁杞1号”“宁杞4号”“宁杞5 号”“宁杞10 号”6 月20 日采收的样品甜菜碱含量均高于7 月20 日采收的，这与王雪媛等[11]研究的肉苁蓉中甜菜碱含量春季显著高于秋季的变化趋势一致。结果表明，不同采收期采集的“宁杞1 号”“宁杞4 号”的甜菜碱含量差异P值分别为0.02、0.035，差异有统计学意义，其他品种含量差异无统计学意义。以甜菜碱含量为指标比较不同采收期之间的差异，发现6 月20 日和7 月20 日采收的宁夏枸杞子中甜菜碱含量均是“宁杞10 号”含量最高。甜菜碱是抗性成分，说明“宁杞10 号”的环境适应力最优。

图3 2个采收期不同品种的枸杞子的甜菜碱质量分数比较（,n=5）

7 月20 日采集的不同品种的枸杞子甜菜碱含量差异有统计学意义，其中“宁杞10 号”甜菜碱含量最高，“宁杞1 号”甜菜碱含量最低，“宁杞10 号”分别与“宁杞4 号”“宁杞5 号”“宁杞7 号”“宁杞0909 号”“宁杞1 号”差异有统计学意义。6 月20 日采集的不同品种的枸杞子甜菜碱含量差异无统计学意义，故未进行讨论。

3.7 2 种加工方式不同品种枸杞子甜菜碱含量的差异比较

由图4 可知，不同加工方式的枸杞子甜菜碱含量具有一定差异，其中“宁杞4 号”烘干与晒干甜菜碱含量基本持平，“宁杞7号”“宁杞0909号”“宁杞10 号”晒干样品甜菜碱含量均高于烘干样品，这与王海等[12]研究的枸杞子在自然晒干条件下比燃煤烘干房烘干条件下甜菜碱含量高的结果一致。表明甜菜碱的含量受烘干方式影响较大，可能也与甜菜碱是一种碱性物质，具有强烈的吸湿性能有关。

图4 2种加工方式不同品种枸杞子的甜菜碱质量分数比较（,n=5）

分析结果表明，“宁杞1号”“宁杞5号”和“宁杞0909号”在烘干和晒干2种方式下甜菜碱含量差异的P值分别为0.07、0.08、0.09，差异有统计学意义，其他品种差异无统计学意义。以甜菜碱含量为指标比较不同加工方式之间的差异，发现烘干加工方式的枸杞子“宁杞5号”含量最高，自然晾晒干采收的枸杞子“宁杞10号”含量最高。与不同采收期结果相比，加工方式对样品中的甜菜碱含量的影响更显著。

烘干方式加工不同品种的枸杞子甜菜碱含量差异有统计学意义，其中“宁杞5 号”甜菜碱含量最高，“宁杞0909号”甜菜碱含量最低，且与“宁杞1号”“宁杞5号”和“宁杞10号”差异有统计学意义。晒干方式加工不同品种的枸杞子甜菜碱含量差异无统计学意义，故不进行讨论。

4 讨论

多糖和甜菜碱是评价枸杞子质量的重要指标之一，同时对于枸杞子的食用口感有着至关重要的作用，在药物与保健食品研发上的发展前景巨大。多糖含量高有利于药食同源的产品开发，对于药食同源产品的开发，选择作为药用的枸杞子其有效成分含量应该更高，而食用枸杞的有效成分含量可以相对较低。不同品种和采收、加工方式均会影响多糖的含量。枸杞子的品种对枸杞子药材品质有一定的影响，但目前研究主要关注的是采收期、加工方式对枸杞子有效成分含量的影响，而对于品种的研究较少。但如今枸杞子药材品种较多，除了“宁杞1 号”“宁杞5号”“宁杞7号”这些常用的品种，还有新选育出的“宁杞0909号”和“宁杞10号”等，值得投入时间对其品种间的含量变化及品质差异进行深入研究，选出更适合不同用途的品种来满足市场需求。

不同采收时间的枸杞子多糖及甜菜碱含量总体差异较小，仅“宁杞10 号”的多糖含量差异有统计学意义，而“宁杞1号”“宁杞4号”的甜菜碱含量差异有统计学意义，均宜选用6月20日作为采收时间。不同加工方式枸杞子，多糖及甜菜碱含量均有一定差异，其中“宁杞4号”“宁杞1号”的多糖含量差异有统计学意义，而“宁杞1 号”“宁杞5 号”和“宁杞0909 号”的甜菜碱含量差异有统计学意义，除“宁杞0909号”以外，均宜选用烘干方式。结果显示，7月份采收及烘干方式加工的“宁杞10 号”多糖含量均显著低于“宁杞4 号”“宁杞7 号”“宁杞5 号”，“宁杞1号”和“宁杞4号”多糖含量最高，食用效果较佳。7 月份采收以及烘干方式加工的“宁杞1 号”及“宁杞4号”甜菜碱含量均显著低于“宁杞10号”“宁杞7号”和“宁杞5号”，“宁杞10号”及“宁杞5号”甜菜碱含量最高，药用效果较佳。

综上所述，本研究比较不同品种、加工方式、采收时间的枸杞子中多糖及甜菜碱含量的变化情况，为枸杞子不同用途适宜品种及其采收期和加工方式的选择提供了参考。