施氮量对超级稻南粳9108产量、淀粉RVA谱特征值和理化特性的影响

李润卿 申 勇 朱宽宇 王志琴 杨建昌

（江苏省作物遗传生理重点实验室/江苏省作物栽培生理重点实验室/江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心/扬州大学农学院，225009，江苏扬州）

水稻是我国最主要的口粮作物，稻谷产量约占粮食产量的1/3，全国约有2/3人口以稻米为主食[1-2]。随着城市化进程的加快，耕地面积逐渐减少，为保障我国粮食安全和人们生活水平，提高单位面积水稻产量迫在眉睫[3-4]。为了解决上述问题，我国开展了“超级稻”项目，经过我国审定的超级稻品种已达130多个[4-6]。与常规水稻品种相比，超级稻品种在相同施氮水平下可以增产12%～14%[7]。虽然选用超级稻品种可以大幅度提高水稻单产，但超级稻的高产离不开氮肥的大量投入，过量的氮肥投入不仅造成了氮肥利用率低，也会使稻米品质变差[8]。以往关于超级稻的研究大多集中在产量方面，在稻米品质层面，尤其对蒸煮食味品质和稻米淀粉理化性质的研究较少。

许多研究[9-12]表明，稻米蒸煮食味品质与其淀粉理化性质关系密切。淀粉中的直链淀粉含量、胶稠度以及糊化温度是衡量稻米蒸煮食味品质的3个重要的理化指标，分别与米饭蒸煮后的柔软性、硬度以及蒸煮时长密切相关[13]。施氮量对水稻稻米蒸煮食味品质有重要影响。有研究[14]认为，增施氮肥会使稻米的蒸煮食味品质变劣，也有研究[15]认为，适量施用氮肥可以改善稻米的蒸煮食味品质。上述结果不一致的主要原因可能在于稻米淀粉的理化特性，包括支链淀粉链长分布、热力学特性、结晶度、有序和无序结构等指标对氮肥用量的响应差异所致[16-18]。目前关于超级稻品种的蒸煮食味品质与稻米淀粉结构和理化性质对施氮量的响应特点，以及淀粉结构和理化特性与蒸煮食味品质的关系还不清楚。本研究对此问题进行探讨，为超级稻高产优质品种的选育和栽培提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与材料

试验于2020年在江苏省扬州市江都区高徐镇试验田进行。试验田前茬为小麦，土壤类型为沙壤土，地力中等偏上，土壤有机质 23.52g/kg、全氮1.50g/kg、碱解氮88.29mg/kg、速效磷34.71mg/kg和速效钾87.92mg/kg。供试水稻品种为超级稻南粳9108。

1.2 试验设计

参试品种于5月28日进行大田育秧，6月25日移栽，株行距为 25cm×15cm，双本栽插，10月31日至11月4日进行收割计产。采用随机区组设计，设置3个施氮量处理，即全生育期不施氮（N0）、施纯氮 180kg/hm2（N180）和 360kg/hm2（N360），重复 3次。小区面积 30m2。施氮量（尿素折合纯氮）分基肥、分蘖肥、促花肥和保花肥4次施用，施用比例为4:2:2:2。试验田全部小区施过磷酸钙（含P2O513%）300kg/hm2，于移栽前作基肥一次性施入；施氯化钾（含K2O 60%）195kg/hm2，分基肥和拔节肥2次施用，施用比例为6:4。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 淀粉提取及直链淀粉含量测定 水稻收获后进行脱粒，并将待测稻谷置于仓库中储存 3个月，待其理化特性稳定后碾磨成精米，再将精米碾磨成米粉，称取米粉20g于0.45%焦亚硫酸钠水溶液中，并加入10mg/g碱性蛋白酶，室温浸泡24h脱蛋白。将酶处理后的匀浆过200目筛，收集筛网上的残留物。将残留物与30mL去离子水混合，搅拌2min，然后再过200目筛。过滤后的淀粉浆以3000转/min离心10min。去掉上清液，去除浅色的上层残留物，剩余白色部分用20mL去离子水悬浮，再以3000转/min离心10min。去除上清液，将上述离心步骤重复 5次，以确保杂质被完全去除。最后，淀粉在30°C的常压下干燥，并用200目筛收集，将去蛋白的淀粉用于淀粉理化性质和结构相关指标[19-21]的测定，用耦合分光光度法[22]测定直链淀粉含量。

1.3.2 淀粉的结晶度（XRD） 取适量淀粉样品，置于样品台上圆形凹槽内并均匀压片，用RU200R型X射线粉末衍射仪（Rigaku，日本）测定淀粉的XRD图谱。所使用的 X射线源是 Cu-K过滤辐射（λ=0.154nm）。X射线管电流和电压分别设定为40mA和40kV。以0.2°/min的扫描速率扫描散射角（2θ），从 5°扫描至 40°。以先前的研究[23]结果为依据确定样品结晶度公式：结晶度（crystallinity，%）=Ac/（Ac+Aa）×100，Ac是结晶峰的面积，Aa是非晶峰的面积。

1.3.3 淀粉的傅里叶红外光谱分布（FTIR） 将50mg淀粉样品加入1mL离心管，再加入100μL超纯水，搅拌成面团胶稠状，覆盖在光谱仪上样孔的表面。FTIR光谱使用Bruker Nexus 670光谱仪获得，DTGS检测器配备 ATR单反射池和钻石晶体（458 入射角）（Nexus 670，Nicolet，Madison，WI，美国）。对于每次测量，在傅里叶变换之前，将64次分辨率为4-1的扫描加在一起。线形假设为洛伦兹线型，半宽为 19cm-1，分辨率增强因子为 1.9，经减水、基线校正和去卷积处理后，从光谱中提取1045、1022和995cm-1处的红外吸收度值（cm-1为波数的单位，即1cm中所含波的个数）。

1.3.4 淀粉的黏滞性谱（RVA谱）特征 称取3.00g淀粉样品放入罐子，加25.00g蒸馏水，将罐子放入仪器，50℃保持1min，以12℃/min的速度上升至95℃，保持 2.5min，再以 12℃/min的速度下降至50℃，并保持2min。搅拌器的转动速度在起始10s内为960转/min，之后保持在160转/min。用快速黏度分析仪（Model 3D，Newport Scientific，澳大利亚）测量相关指标，并用其配套软件TCW（thermal cycle for windows）进行数据分析，对大米淀粉的黏度特性进行评价。

1.3.5 淀粉的热力学特性 用差示扫描量热仪DSC8500（PERKIN ELMER）对淀粉的热力学特性进行研究。每个样品（5mg，干重）装入铝锅内（25/40mL，D=5mm），加入蒸馏水，获得含水量为66.7%的淀粉―水悬浮液。样品密封，在4℃下放置24h，然后在DSC中加热。DSC分析仪以空铝锅为参照物进行校准。在 20℃～100℃范围内，以10℃/min的速率加热样品盘，将淀粉样品的热转变定义为起始温度、糊化温度（峰值温度）、终止温度、糊化焓和回生焓。焓以淀粉干重为基础计算[22]。

1.3.6 淀粉的膨胀度与溶解度 称取35mg（m0）淀粉样品放于已知质量的离心管（m1）中，加入超纯水，经震荡、水浴加热和离心后，弃去上清，称重（m2），烘干后称取总质量（m3），附着在离心管上的胶体为其吸水膨胀的质量，通过以下公式计算：溶解的质量（m4，g）=m0-（m3-m1）；溶解度（%）=m4/m1×100；膨胀度（g/g）=（m2-m1）/（m3-m1）。

1.3.7 荧光团辅助标记碳水化合物电泳法（FACE）分析支链淀粉的链长分布 参考Wu等[24]方法并做了一些修改以制备线性葡聚糖样品和标记。称取支链淀粉脱分支0.2～0.3mg的干燥线性葡聚糖样品于2mL微量离心管中。4000转/min离心2min（将粉末压到试管底部），然后添加 1.5μL浓度为0.2mol/L 8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐（APTS）―15%冰醋酸溶液（将APTS粉溶解在15%冰醋酸中以获得0.2mol/L的APTS溶液）。将混合物用旋涡混匀器混匀并在黑暗中以40℃孵育20h或60℃孵育90min，用以标记支链淀粉脱分支样品[25]。之后加入80μL水并用旋涡混匀器混匀，直到所有沉淀溶解。将混合物经4000转/min离心2min，然后将50μL上清液转移至200μL微量离心管中，立即进行荧光团辅助标记的碳水化合物电泳。用FACE分析标记的线性葡聚糖（如上所述制备）的尺寸分布，得到链长分布（CLD）并表示为Nde(X)（下标“de”表示通过脱支淀粉获得线性葡聚糖；X=DP，DP表示聚合度）。在PA-800 Plus系统上进行标记线性葡聚糖的分离，使用固态激光诱导荧光（LIF）检测器进行监测，并以氩离子激光作为激发源（Beckman-Coulter，Brea，CA，美国）。

1.3.8 产量及其构成因素 成熟期各个小区按照平均穗数取20穴用于考察单位面积穗数、穗粒数、结实率和千粒重。同时每小区取5穴水稻植株，按穗、茎、叶分开，烘箱烘干至恒重，用凯氏定氮仪Foss 8400测定氮含量，计算氮肥利用率指标。在收获前1d每个小区收割5m2，脱粒测产。

1.4 数据处理

用Microsoft Excel 2013和SPSS 19.0软件进行数据处理与统计分析。氮肥利用率指标的计算参照Xue等[26]的方法。

2 结果与分析

2.1 不同施氮量对产量及其构成因素的影响

由表1可得，与N0处理相比，N180处理下南粳9108产量增幅为46.33%，穗粒数增加29.31%，穗数增幅为23.61%；N360处理穗粒数增加36.21%，穗数增幅为 35.62%。N360处理下南粳9108的产量、穗数及穗粒数均最高。3个氮肥处理相比，N0处理下南粳9108的结实率最高，N360处理下结实率最低，且各处理差异显著。与N180处理相比，N360处理下的千粒重有所降低但无显著差异。

表1 不同施氮量条件下南粳9108产量及其构成因素Table 1 Yield and its components of Nanjing 9108 under different nitrogen application rates

2.2 不同施氮量对南粳9108氮肥利用率的影响

由表2可得，在3个施氮水平下，南粳9108的氮肥农学利用率和氮肥偏生产力在N180处理下最高，氮素产谷利用率及收获指数在N0处理下最高。3个氮肥处理相比，南粳9108总吸氮量在N360处理下最大，N180处理总吸氮量比 N0处理增加71.37%，N360处理的总吸氮量比 N180处理增加20.12%，氮肥农学利用率、氮肥偏生产力、氮素产谷利用率和氮素收获指数总体呈降低趋势。

表2 不同施氮量条件下南粳9108的吸氮量及氮肥利用率Table 2 Nitrogen uptake and nitrogen use efficiency of Nanjing 9108 under different nitrogen application rates

2.3 不同施氮量对南粳9108淀粉理化性质的影响

2.3.1 蛋白质、直链淀粉含量及胶稠度 由表3可得，3个氮肥处理相比，N360处理下蛋白质含量最高，且各处理间差异显著；N360处理下直链淀粉含量最低，与N180处理相比无显著差异；N180处理下南粳9108的胶稠度最大，N0和N360处理下胶稠度均较N180处理显著降低。

表3 不同施氮量条件下南粳9108的蛋白质、直链淀粉含量和胶稠度Table 3 Protein content, amylose content and gel consistency of Nanjing 9108 under different nitrogen application rates

2.3.2 淀粉RVA谱特征值 由表4可知，在3个氮肥水平下，南粳 9108的峰值黏度、热浆黏度、崩解值及糊化温度均随施氮量的增加呈先升后降的趋势，N180处理下的峰值黏度、热浆黏度和崩解值最大，消减值最低。N360处理下的峰值黏度、热浆黏度和崩解值最低，消减值最高。

表4 不同施氮量下南粳9108籽粒淀粉RVA谱特征值Table 4 RVA profile characteristics of starch of Nanjing 9108 grains under different nitrogen application rates

2.3.3 淀粉的结晶度和傅里叶红外光谱（IR）值由表5可得，南粳9108的淀粉结晶度表现为N360＞N0＞N180。在淀粉的IR值中，1045/1022cm-1表示淀粉颗粒外部区域的有序结构含量，1022/995cm-1表示淀粉颗粒外部区域的无定形结构含量。南粳9108的1045/1022cm-1表现为N360＞N0＞N180，1022/995cm-1表现为N180＞N0＞N360。

表5 不同施氮量条件下南粳9108淀粉的结晶度与傅里叶变换红外光谱（IR）值Table 5 Crystallinity and IR values of Nanjing 9108 starch under different nitrogen application rates

2.3.4 淀粉的热力学特性 由表6可得，在各氮素水平下，南粳 9108的起始温度无显著差异，峰值温度和终止温度均表现为先升后降趋势。南粳9108在N180处理下糊化焓最低，N360处理下最高，各处理间差异显著。回生焓和回生度均在N180处理下最高，说明施氮量为180kg/hm2时可以降低南粳9108糊化所需要的能量。

表6 不同施氮量下南粳9108淀粉热力学特征值Table 6 Thermodynamic characteristic values of Nanjing 9108 starch under different nitrogen application rates

2.3.5 淀粉的溶解度与膨胀度 由表 7可得，与N0处理相比，南粳9108在N180处理下的淀粉溶解度和膨胀度均显著提升，而在N360处理下的溶解度和膨胀度均显著降低，这说明施氮量在180kg/hm2时可以使南粳9108的溶解度和膨胀度显著提高，过量施氮会导致南粳 9108的溶解度和膨胀度降低。

表7 不同施氮量条件下南粳9108淀粉的溶解度和膨胀度Table 7 Solubility and expansion of Nanjing 9108 starch under different nitrogen application rates

2.3.6 支链淀粉脱分支的链长分布 支链淀粉脱分支后的链长可分为A链（DP6＜12，短链）、B1链（13＜DP＜24，中链）、B2链（25＜DP＜36，中长链）和B3链（DP＞37，长链）。由表8可得，南粳9108 A链和B1链分布比例表现为N180＞N0＞N360；在3个氮素水平下，B2链和B3链的分布比例具体表现为N360＞N0＞N180。

表8 不同施氮量条件下南粳9108支淀粉不同链长分布比例Table 8 Different chain length distribution ratio of Nanjing 9108 amylopectin under different nitrogen application rates %

2.3.7 淀粉理化性质和淀粉结构的相关性分析

由表9可得，南粳9108的结晶度和1045/1022cm-1值与糊化焓以及糊化温度呈显著或极显著正相关，与崩解值、溶解度以及膨胀度呈显著或极显著负相关。1022/995cm-1值与消减值、糊化焓以及糊化温度呈极显著负相关，与崩解值以及膨胀度呈显著或极显著正相关。

表9 南粳9108籽粒淀粉晶体稳定性与其理化性质的相关性分析Table 9 Correlation analysis between starch crystal stability and physicochemical properties of starch in Nanjing 9108 grains

由表10可得，南粳9108的支链淀粉脱分支A链和B1链含量与淀粉结晶度、1045/1022cm-1值、消减值、糊化温度和糊化焓呈显著或极显著负相关，与1022/995cm-1值、崩解值、溶解度和膨胀度呈显著或极显著正相关。支链淀粉脱分支B2链和B3链含量与淀粉结晶度、1045/1022cm-1值、糊化温度和糊化焓呈显著或极显著正相关，与1022/995cm-1值、崩解值、溶解度和膨胀度呈显著或极显著负相关。

表10 南粳9108籽粒支链淀粉脱分支链长分布与淀粉理化性质的相关性分析Table 10 Correlation analysis between the distribution of amylopectin debranching chain length and the physicochemical properties of starch in Nanjing 9108 grains

3 讨论

3.1 南粳9108产量对施氮量的响应特点

有研究[27-29]表明，水稻库容的大小取决于水稻单位面积有效穗数或穗粒数，增加水稻的总颖花量是提高水稻单产的重要途径之一。库容大是超级稻品种高产的重要农艺特征，而氮肥量增加是提高单位面积库容最快捷的措施[30]。有研究[31]表明，超级稻品种产量随施氮量的增加而增加，特别是在高施氮量下产量潜力大，但关于超级稻产量随施氮量的提高而增加是取决于穗粒数增幅对施氮量响应高，还是单位面积穗数增幅响应高，目前还不清楚。本研究观察到，南粳9108产量在N180处理下显著提高的主要原因在于穗粒数的大幅度提高，但在N360处理下穗粒数的增幅和单位面积穗数的增幅相近，以上结果表明，超级稻南粳9108的单位面积穗数和穗粒数的增幅因施氮水平而异，同时也表明高施氮量可以协同单位面积穗数和穗粒数提高。值得注意的是，增加施氮量虽然可以提高南粳9108的吸氮量，但其氮肥利用率指标逐渐降低，如氮肥偏生产力、氮肥农学利用率、籽粒氮素利用率以及氮素收获指数；关于促进水稻对氮素吸收的同时提高水稻氮肥利用效率方面有待深入研究。

3.2 南粳 9108的 RVA谱特征值对施氮量的响应差异及其淀粉理化原因

RVA谱特征值与稻米蒸煮食味品质密切相关[32-33]，RVA谱特征值可以直接反映稻米口感及食味品质的优劣、稻米蒸煮过程中升温和降温时米饭的糊化特性及黏滞性变化[25,34-36]，改善稻米RVA谱特征值对优化食味品质及选育优质稻米工作具有指导性意义[12]。本研究观察到，南粳9108的崩解值、峰值黏度、热浆黏度和糊化温度均在N180处理下最高，消减值最低；在N360处理下则相反。上述结果表明，适量施氮（N180）可以使南粳9108稻米易于糊化，改善其蒸煮特性，使稻米蒸煮后不易回生，增加米饭适口性[12,36]，过量施氮则使南粳9108的蒸煮性和适口性变差。南粳9108在N180水平下RVA谱特征值较优的原因可能是南粳9108在 N180水平下具有较高的溶解度、1022/995cm-1值、膨胀度及胶稠度，较低的结晶度、糊化焓和直链淀粉含量（与N360水平下无显著差异）；并且相对结晶度和淀粉有序结构（1045/1022cm-1值）与糊化焓以及糊化温度呈显著或极显著正相关，与崩解值、溶解度及膨胀度呈显著或极显著负相关，淀粉晶体无序结构（1022/995cm-1值）则相反。这些结果有助于N180处理下南粳9108稻米蒸煮时淀粉晶体稳定性变差，利于糊化，同时也有利于米饭蒸煮冷却后不易回生，米饭较软，适口性较好[12,37]。

本研究进一步观察到，N180处理下南粳9108支链淀粉A链和B1链含量占比增加，B3链含量占比降低，高施氮量（N360）则相反；相关性分析表明，支链淀粉A链和B1链含量占比与崩解值、溶解度、1022/995cm-1值和膨胀度呈现显著或极显著正相关，与消减值、结晶度、糊化温度、1045/1022cm-1和糊化焓呈显著或极显著负相关，B3链含量与上述淀粉理化指标的相关性相反。有研究认为，支链淀粉短中链含量与稻米的蒸煮食味品质密切相关[36]，即支链淀粉短中链含量占比越多，稻米的蒸煮食味品质越好[38]。支链淀粉中较高的短中链含量可以提高稻米的蒸煮食味性的原因，根据本研究结果，推测支链淀粉中短中链含量高可以优化RVA谱相关特征值，具体为支链淀粉短中链含量高可以增加淀粉晶体的无序结构（1022/995cm-1值）[39]，淀粉中的无序结构越多，结晶度就越小[13]，有利于淀粉溶解度和膨胀度的提高，使淀粉遇水快速析出，形成含水胶体，因此所需糊化淀粉的热量变低（即热焓值低）[40]，同时淀粉短中链含量越多，可以使熟米更加柔软富有黏性，提高崩解值，降低消减值[41]，最终使稻米具有更好的蒸煮食味性。

3.3 关于超级稻品种产量、品质和氮肥利用效率的协同提高

在我国的水稻生产中，尤其对于超级稻品种，为确保其产量潜力的最大化，增加氮肥用量是最直接有效的方式[42]，但过量的氮肥投入不仅导致环境问题，致使氮肥利用率降低，也使水稻植株整体氮水平较高，特别是当水稻籽粒蛋白质含量较高时不利于淀粉颗粒的排列以及淀粉内在结构的塑造，导致稻米蒸煮食味性差等问题[42-44]。有研究[43-45]显示，水稻的高产与优质存在冲突，特别是高产与稻米蒸煮食味性之间的矛盾。如何协同提高水稻产量和稻米品质一直是水稻生产中的热点问题[45]。稻米品质除受本身遗传因素影响外，也受环境和栽培措施的影响，改进栽培措施是提高稻米品质的有效途径[45]。近年来，“实地氮肥管理”[46-47]、“水分管理技术”[34,48]、“田间综合管理”[49]以及“秸秆还田”[50-51]等栽培措施不仅可以减少氮肥的投入，协同提高产量和氮肥利用率，同时也能显著改善稻米品质。在本试验中，超级稻南粳9108在N180处理下蒸煮食味性最好，产量为9.16t/hm2，达到了水稻生产中的高产标准[52]，但是距离我国中、晚稻超级稻10.5t/hm2（700kg/亩）[53]以上的产量标准还存在一定的差距，虽然本试验中N360处理下的产量表现已接近该标准，但稻米品质变劣，氮肥利用率降低。说明仅调节施氮量这一栽培措施难以实现水稻产量、品质和氮肥利用效率的协同提高，今后需要深入研究水稻高产、优质、氮肥高效利用的综合栽培技术。

4 结论

在施氮量0、180和360kg/hm2处理下，超级稻品种南粳9108的产量逐渐增加，各处理间差异显著，氮肥利用率则逐渐降低。与不施氮相比，施氮量180kg/hm2时可改善南粳9108的蒸煮食味品质，高施氮量（N360）则会使其蒸煮食味品质变劣。在施氮量180kg/hm2条件下，支链淀粉短中链含量占比、崩解值、淀粉的无序结构、胶稠度、溶解度和膨胀度的提高，直链淀粉含量、糊化焓、结晶度和消减值的降低，是稻米蒸煮食味品质改善的重要原因。