三华李红色素的提取及抗氧化性的测定

刘艳灿，朱仕兰，崔燕玲，贺劲锋，高柔敏，许伊妍

（佛山职业技术学院，广东佛山 528000）

三华李为蔷薇科李属植物，果实为圆形或近圆形，果皮淡紫色，果肉紫红色[1]。因早在广东韶关翁源县三华镇种植而得名，近年来广东信宜“银妃”三华李因果大、肉厚、汁甜、色美屡屡在国内省内名特优农产品展示和质量评比活动中获誉[1]。研究表明，三华李的果实含有丰富的矿质元素（如钾、钠、磷、镁、锌和铜等）和维生素（如维生素A、维生素D、维生素B1和维生素B2等），且其有机酸含量和种类尤其丰富，对人体健康大有裨益[2-3]。

近年来，对三华李的产品加工主要集中在果肉制作，如腌制成蜜饯、制作成果糕、酿制果酒，但是对其剩余物的有效成分的综合研究利用相对较少，如加工后剩余的果渣、果皮等[1,4-6]。这样不仅造成果渣中有效成分的流失浪费，严重时还可能污染环境[7]。目前的报道中对三华李的果实果渣进行再利用提取其中天然色素的报道较少，本试验选择提取三华李红色素，其主要成分为花青素，花青素属天然的水溶性色素，主要存在于果皮、果肉中[8-10]。

近年来，由非法添加物导致的食品安全事故频繁发生，人们普遍担心人工合成色素的安全性。由此，针对从植物组织中提取的安全无毒的天然色素的研究得到了广泛的关注[11-13]。花青素对植物具有重要的生理功能，还具有抗氧化活性，是一种优良的天然抗氧化剂和自由基清除剂，在食品、医药、化妆品等方面拥有较大的发展市场[14-16]。本试验探究了三华李中红色素的提取工艺，同时对粗提取物测定抗氧化活性，为进一步开发天然食用色素提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三华李品种为广东省信宜市钱排镇“银妃”三华李；柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙醇、乙醚、水杨酸、过氧化氢、FeSO4溶液、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和L(+)-抗坏血酸和2,6-二叔丁基对甲酚（BHT），均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

1.3 试验方法

1.3.1 提取工艺

三华李红色素的提取工艺为果肉预处理→加入提取剂并捣碎→室温酶解→抽滤得滤液→真空浓缩→红色素浓缩液。

1.3.2 最佳波长的确定

根据前期预试验得出，三华李红色素最佳检测波长为460 nm。

1.3.3 提取剂的选择

取去核果肉加入料液比1∶1（m∶V）的提取剂[pH=4的缓冲溶液（柠檬酸钠、磷酸）、pH=4的50%乙醇、pH=4的无水乙醇、磷酸钠缓冲溶液和pH=4的乙醚]，捣碎后在室温条件下放置20 min，抽滤并收集滤液，分别将滤液稀释50倍在460 nm波长下进行吸光度值的测定，确定提取效果最佳的提取剂。

1.3.4 三华李红色素提取条件的单因素试验

尽管生物质能烤房设备烘烤烟叶燃烧的都是生物质。但由于不同设备对温湿度控制的响应速度和协同运行效率不同，可直接影响整个烤房供热设备的综合热效率，进而影响烟叶烘烤成本及推广价值。从表2可知，单烤燃料消耗，常规燃煤烤房(CK)为727 kg，不同生物质能烤房为848～906 kg，生物质燃烧机烘烤烟叶消耗燃料比燃煤高，其主要原因是生物质颗粒的燃值低于煤炭的燃值。综合热效率，生物质燃烧机热效率比燃煤烤房高13%～15%。不同类型的生物质烤房的热效率各有差异，其中，T3最高，达51.9%；T2其次，为50.8%；T4最低，仅48.3%，但仍高于CK。

（1）料液比的确定。取等量三华李去核果肉加入不同体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液并捣碎，在室温条件下放置20 min，抽滤并收集滤液，滤液于60 ℃的旋蒸器上60 min，取得粗提物，分别将粗提取物稀释50倍在460 nm波长下进行吸光度值的测定，确定提取效果最佳的料液比。

（2）放置时间的确定。分别取等量三华李去核果肉加入相同提取剂后捣碎，在室温条件下放置0 min、10 min、20 min、30 min和40 min，抽滤并收集滤液，滤液于60 ℃的旋蒸器上60 min，取得粗提物，分别将粗提取物稀释50倍在460 nm波长下进行吸光度值的测定，确定提取效果最佳的放置时间。

（3）放置温度的确定。分别取等量三华李去核果肉加入相同提取剂后捣碎，在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃下放置一定时间，抽滤并收集滤液，滤液于60 ℃的旋蒸器上60 min，取得粗提物，分别将粗提取物稀释50倍在460 nm波长下进行吸光度值的测定，确定提取效果最佳的放置温度。

（4）旋蒸温度的确定。分别取等量三华李去核果肉加入相同提取剂后捣碎，在一定温度下放置一定时间，抽滤并收集滤液，滤液于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃旋蒸60 min，取得粗提物，分别将粗提取物稀释50倍在460 nm波长下进行吸光度值的测定，确定提取效果最佳的旋蒸温度。

（5）旋蒸时间的确定。分别取等量三华李去核果肉加入相同提取剂后捣碎，在一定温度下放置一定时间，抽滤并收集滤液，在一定温度下旋蒸40 min、50 min、60 min、70 min和80 min，取得粗提物，分别将粗提取物稀释50倍在460 nm波长下进行吸光度值的测定，确定提取效果最佳的旋蒸时间。

1.3.5 三华李红色素抗氧化性质研究

（1）羟基自由基（·OH）清除能力测定[17-18（]同时以抗坏血酸进行同样处理作为参照）。将粗提物加入95%乙醇定容至10 mL，取样品溶液1 mL，依次加入2 mL浓度为6 mmol·L-1的FeSO4溶液，再加入6 mmol·L-1H2O2溶液2 mL，充分混匀后室温静置10 min，加入2 mL新配制的6 mmoL·L-1水杨酸溶液并混匀，在37 ℃下放置30 min，在510 nm波长处测其吸光度值。同时进行空白（A0）和样品对照（A1）处理，样品溶液对羟自由基（·OH）的清除率的计算公式为

式中：A为试验组（样液+水杨酸）吸光度值；A1为对照组（样液+空白溶剂）吸光度值；A0为空白组（水杨酸+空白溶剂）吸光度值。

（2）DPPH自由基清除能力测定。以95%的乙醇作为溶剂，将DPPH自由基配制成浓度为0.1 mmol·L-1的溶液，DPPH溶液要现配现用。取不同浓度的红色素溶液各1.0 mL，加入等体积的DPPH溶液，充分混合，在室温25 ℃下避光放置30 min，测定混合溶液在517 nm处的吸光度，以95%乙醇作为空白对照。再以BHT作为阳性对照，在相同条件下进行实验[19]。DPPH自由基阳离子清除率计算公式为

2 结果与分析

2.1 提取剂的选择

不同提取剂对三华李红色素的提取效果的影响结果见表1。各类提取剂对三华李红色素的提取效果为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液提取三华李红色素的吸光度与色泽效果最好，溶液颜色呈紫红色，与果肉颜色很贴近；磷酸钠缓冲溶液在浸提中溶液色泽也接近原果肉色，但吸光度较低；50%乙醇和乙醚在浸提中滤液颜色与其他提取剂区别较大，为黄色和淡黄色，提取物可能多为黄酮类成分物质[7]。无水乙醇浸提后的溶液颜色比缓冲溶液浸提后的颜色偏浅，吸光度较低。因此，pH=4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液提取三华李红色素的效果最好。

2.2 不同条件下三华李红色素的提取的单因素试验结果

2.2.1 料液比对三华李红色素提取效果的影响

由图1可知，料液比在1∶1时三华李红色素的吸光度值最大。料液比小于1∶1时，果肉破碎不够完全影响色素的有效提取。当料液比从1∶1到1∶3时，提取溶液的吸光度值急剧下降，而后呈缓慢下降趋势，到1∶5时吸光度值的变化趋势已比较平缓。可能是在超过合适的料液比后，增加提取剂的用量会稀释提取出的三华李红色素的浓度，导致吸光度值下降。而且过多的水分给后续的提取工作增加难度。因此，选择料液比1∶1作为本试验的最佳料液比。

图1 料液比对三华李红色素提取效果的影响

2.2.2 放置时间对三华李红色素提取效果的影响

由图2可知，放置时间在0～20 min时，提取效果变化不明显，当放置时间增加到30 min后吸光值随着放置时间的延长而减少，当放置时间为40 min时吸光度值急剧下降，与放置时间为20 min的提取效果差别不大。可能原因是放置时间较短时，三华李细胞未能充分吸水破裂导致色素成分无法释放出来，当放置时间过长时反应酶与红色素发生反应导致红色素含量下降，提取液的吸光度值下降。因此，最佳放置时间为30 min。

图2 放置时间对三华李红色素提取效果的影响

2.2.3 放置温度对三华李红色素提取效果的影响

由图3可知，随着放置温度的升高，提取液的吸光度逐渐上升，当温度达到50 ℃时，吸光度达到最大。随后，吸光度随温度的升高而下降。适宜的放置温度能促进三华李中红色素的溶出，温度过高可能会导致色素分解或氧化。综合考虑，选择50 ℃作为三华李红色素提取温度，既可保证红色素在此温度下不被分解或被氧化，同时红色素的浸出率较高。

图3 放置温度对三华李红色素提取效果的影响

2.2.4 旋蒸温度对三华李红色素提取效果的影响

由图4可知，旋蒸温度在30～50 ℃时，吸光值随温度升高而升高。当旋蒸温度到50 ℃时提取液的吸光度值达到最大。继续升高旋蒸温度，吸光度开始缓慢下降。这可能是因为旋蒸温度较低时红色素未能充分溶出，此时吸光度值较低，当旋蒸温度过高时，属于热敏性物质的红色素在高温被结构破坏导致吸光度值下降。因此，最佳旋蒸温度为50 ℃。

图4 旋蒸温度对三华李红色素提取效果的影响

2.2.5 旋蒸时间对三华李红色素提取效果的影响

由图5可知，旋蒸50 min时吸光度值达到最大，50 min后吸光度值呈缓慢下降的趋势。原因可能是在一定范围内旋蒸时间的增加有利于红色素的充分溶出，继续增加旋蒸时间会使得溶出的红色素在50 ℃的旋蒸温度下逐渐被破坏分解。综上，最佳旋蒸时间为50 min。

图5 旋蒸时间对三华李红色素提取效果的影响2.3 三华李红色素抗氧化性的测定

2.3.1 三华李红色素对羟基自由基清除能力的测定

由图6可知，三华李红色素与维生素C对羟基自由基的清除率在试验浓度内均随质量浓度的增加而增大。但相同浓度的维生素C对羟基自由基的清除能力比三华李红色素强。综上，三华李红色素对羟基自由基有一定的清除能力。

图6 三华李红色素质量浓度对羟基自由基的清除效果

2.3.2 三华李红色素对DPPH清除能力的测定

由图7可知，随着试验浓度内质量浓度的增大，三华李红色素与维生素C对DPPH的清除能力逐步提高。但相同浓度的三华李红色素对DPPH的清除能力弱于维生素C的清除能力。综上，三华李红色素对DPPH有一定的清除能力。

图7 三华李红色素质量浓度对DPPH的清除效果

3 结论

本试验以三华李为原料，提取的三华李红色素是水溶性的天然色素。通过单因素试验确定了三华李中红色素的最佳工艺条件为以pH=4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液作为提取剂，料液比为1∶1，放置温度50 ℃，放置时间30 min，旋蒸温度50 ℃下旋蒸50 min。在此条件下提取液的吸光度值最高且溶液呈紫红色。此外，三华李红色素对羟基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）有较好的清除能力，可为三华李的综合利用提供较好的研究基础。