铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白的作用及机制研究进展

万 璐，吴小军

(武汉大学人民医院呼吸和危重症科，湖北 武汉 430060)

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是一种适应性很强的条件致病菌，其拥有较强的代谢可塑性、多样性及产毒性[1]。PA感染常发生在烧伤、癌症、呼吸道感染等免疫力低下患者，已在世界范围内造成严重的院内感染[2-3]。2017年，PA被世界卫生组织认定为最具威胁性的细菌之一，同时也被列为急需新药治疗的重点病原体之一。Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system，T3SS)是PA急性感染过程中的关键毒性因子[4]，该系统可将细菌分泌的几种效应蛋白靶向注入宿主细胞内，这些效应蛋白可在宿主细胞内激活并帮助细菌逃避宿主细胞的吞噬。胞外酶U(exoenzyme U，ExoU)、胞外酶S(exoenzyme S，ExoS)、胞外酶T(exoenzyme T，ExoT)和胞外酶Y(exoenzyme Y，ExoY)是目前功能比较明确的4种PA的T3SS的效应蛋白。目前，普遍认为T3SS及其主要的效应蛋白是PA感染宿主细胞并致病的关键，越来越多的学者致力于T3SS及其效应蛋白的调控机制、抑制剂的研究，以期为PA的治疗提供新的思路。本文就PA的T3SS的结构组成及其效应蛋白分泌方式、作用机制相关研究进行综述，并对该系统和效应蛋白的针对性治疗策略进行展望,旨在为新型抗菌药物的研发提供理论基础。

1 T3SS结构组成

1996年首次发现PA的T3SS，并于后续的研究中确定T3SS是一套结构和功能高度保守的蛋白传递系统[5]。PA中的T3SS总体结构形似注射器针头状装置，故被称为T3SS注射装置。根据功能可将T3SS的组成蛋白分为细菌膜装置蛋白、转位子蛋白、效应蛋白和分子伴侣4类。细菌膜装置蛋白是T3SS的结构基础，横跨细菌细胞内外膜，形似指向细胞外的注射体。转位子蛋白主要是指与宿主细胞接触并可转运效应蛋白的部分。T3SS的效应蛋白主要有ExoU、ExoY、ExoT和ExoS，这4种效应蛋白几乎不会在同一细菌内同时表达，同一株PA也不会同时携带ExoS基因和ExoU基因。近期有学者提出了一些新的效应蛋白，如PA效应蛋白A和B[4]，但其具体结构组成、功能还有待进一步研究。T3SS的分子伴侣多为小分子酸性蛋白，如PA ExoS和ExoU的特异性分子伴侣(SpcS和SpcU)等，可特异性与效应蛋白结合，在效应蛋白转运过程中维持蛋白的稳定性。

PA的调控基因中，与编码、调控相关的5个操纵子(pscNOPQRSTU、popNpcr1234DR、pcrGVHpopBD、exsCEBA和exsDpscBCDEFGHIJKL)在染色体上相邻构成了毒力岛，而编码效应蛋白和分子伴侣的基因则位于染色体的其他位置上[6-7]。

2 效应蛋白

目前发现了多种PA的效应蛋白，其中已明确功能的主要有ExoU、ExoS、ExoT和ExoY 4种，这些效应蛋白可直接进入宿主细胞内，引起宿主细胞凋亡。

2.1 ExoUExoU是由687个氨基酸组成、相对分子质量为 74 000的水溶性蛋白质。ExoU具有磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)活性，属于钙非依赖性磷脂酶[8]，该酶的作用可导致宿主细胞快速裂解。ExoU在空间结构上可折叠为4个结构域[9]，结构域1位于靠近N端的55～101位氨基酸，结构域1是分子伴侣SpcU结合区，SpcU与结构域1结合后可使ExoU在细菌胞质中处于失活状态，SpcU还能引导ExoU进入T3SS，随后进入宿主细胞内发挥作用；结构域2是PLA2结构域，位于106～471位氨基酸，是由丝氨酸(Ser142)和天冬氨酸(Asp344)残基组成的催化二联体；结构域3和4位于ExoU的C端的480～580位氨基酸和588～687位氨基酸，结构域4是一个四螺旋束的膜定位区，结构域3和4主要发挥膜稳定的功能，使ExoU能够靶向进入宿主细胞膜的区域发挥作用。研究报道，结构域3可能是一个泛素结合位点[10]，真核细胞泛素[11]、泛素化蛋白及Cu/Zn超氧化物歧化酶1都可能是ExoU的重要活化因子。

ExoU发挥磷脂酶作用需要真核细胞提供激活因子，这是细菌的一种自我保护机制，在水解宿主细胞的膜性结构的同时不影响自身的膜结构。另外，在早期感染中，ExoU对中性粒细胞等细胞的侵袭能力较强，导致宿主防御功能下降，因此，亟须研制特异性的抑制剂，在早期有效控制感染，从而减轻患者的症状，改善患者的预后。

2.2 ExoS和ExoTExoS和ExoT的编码基因约有76%的序列同源性，二者蛋白质链的羧基端均为二磷酸腺苷核糖转移酶(adenosine diphosphate ribosyltransferase，ADPr)结构域，氨基端均为三磷酸鸟苷酶活化蛋白(GTPase activating protein，GAP)结构域[12-14]。ExoS和ExoT均能与分子伴侣SpcS结合从而进一步发挥作用。ExoS和ExoT的Rho GAP的活性在生理和生物化学特性上完全相同，作用于真核细胞的小分子GTP酶，导致宿主细胞肌动蛋白骨架破坏，降低吞噬细胞对细菌的吞噬作用[15-16]。

2.2.1 ExoSExoS由453个氨基酸组成，ADPr是ExoS发挥作用的最主要酶，ADPr作用的靶蛋白范围广泛，包括埃兹蛋白、根蛋白、膜突蛋白以及具有GTP酶活性的小G蛋白家族。ADPr会引起宿主细胞膜骨架的ADP核糖磷酸化，抑制DNA合成和囊泡运输作用，引起宿主细胞内的信号传导过程失偶联，诱导细胞凋亡。ExoS还具有T淋巴细胞丝裂原作用，可促进T淋巴细胞有丝分裂，诱导大量T淋巴细胞活化，这种作用与ADPr的活性无关，由此活化的T细胞易凋亡。之前的观点认为PA是一种在宿主细胞外发挥作用的细菌，但近来的研究表明，PA的效应蛋白ExoS的ADPr可以促进细菌在宿主细胞的内化，尤其是在上皮细胞内，并且保护宿主细胞内环境的相对稳定，延长宿主细胞的生存时间，抵抗ExoS和ExoT的Rho GAP酶的抗吞噬作用，使得细菌在宿主细胞内持续复制、繁殖[15-17]。ExoS 的ADPr酶促进细菌与上皮细胞共存可能与上述提到的ExoS的诱导细胞凋亡的过程相悖，仍需进一步的研究证实。

2.2.2 ExoTExoT由457个氨基酸组成，是唯一一种在所有PA中都表达的效应蛋白，这表明ExoT在PA中发挥最基本的功能。ExoT具有与ExoS相同的ADPr活性，但其作用的底物并不完全相同，ExoT 的ADPr可靶向作用于Crk样蛋白(CrK-like proteins，CRKL)和糖酵解酶磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)。CRKL是一种细胞内信号结合蛋白，可在肺癌、胃癌、胰腺癌等癌细胞内表达，参与细胞内细胞因子、生长因子及BCR-ABL 融合蛋白等的信号转导，促进癌细胞的增殖、分化、结合和转移[18]。PGK1是糖酵解过程中的关键代谢酶，催化1，3-二磷酸甘油酸转化为3-磷酸甘油酸，产生糖酵解途径中的第1个ATP。PGK1除了发挥催化产能的活性，还是一种蛋白激酶，参与多种癌基因的表达和调控，影响肿瘤中与增殖转移有关的信号通路，对肿瘤细胞的增殖、生长和转移表现出明显的促进作用[19]。有研究表明，ExoT是PA抗击宿主炎症细胞的关键效应蛋白，这与ADPr作用于细胞内的CRKL激活宿主细胞的凋亡通路相关[20]，ExoT的ADPr还能作为诱导肿瘤细胞凋亡的重要分子[18-19，21]。

2.3 ExoYExoY由378种氨基酸组成，与其他3种效应蛋白不同的是目前ExoY的分子伴侣尚未明确。ExoY具有核苷酸环化酶的作用，ExoY进入宿主细胞后通过与F-肌动蛋白结合而激活，促进宿主细胞产生核苷酸，如环磷酸腺苷等，这些单磷酸环核苷酸的升高会引起内皮细胞tau蛋白过度磷酸化，从而使微管破裂、内皮细胞通透性增高，导致细胞水肿乃至凋亡[22-24]。有研究表明，ExoY分泌缺乏的PA菌株要比ExoY分泌活跃的PA菌株的毒力更大，即ExoY可能具有缓解PA毒力的作用[25]。这可能是细菌延长自身生存、维持宿主慢性感染的一种方式。

3 PA的T3SS及效应蛋白抑制剂的研究进展

PA的耐药形势日益严峻，现已严重威胁人类的生命健康。PA由于其高耐药性和基因多样性，临床防治具有一定的挑战性[26],因此，亟须开发新的作用模式的抗菌药物，如针对PA的T3SS及其分泌的效应蛋白的抑制剂。

3.1 亚水杨基酰肼类亚水杨基酰肼衍生物是一类小分子物质，能够抑制PA的T3SS的分泌、转录等，其活性化合物对T3SS抑制率的半抑制浓度一般在5～25 mol·L-1[27]。亚水杨基酰肼衍生物的抑制作用可表现在以下几个方面：下调T3SS相关基因的转录作用；抑制T3SS效应蛋白的分泌和转运；影响细菌的运动能力等。近年来，对于亚水杨基酰肼衍生物研究较多，已知的几种类型的亚水杨基酰肼类药物如INP0010、INP0400、INP0007对沙门菌、志贺菌和耶尔森菌中的T3SS有较好的抑制作用。亚水杨基酰肼INP0341也被证实可抑制PA的生物膜形成，减弱其感染能力[28]。

3.2 苯氧乙酰胺类苯氧乙酰胺类抑制剂通过作用于PA的T3SS针尖样结构上的PscF蛋白，特异性影响T3SS效应蛋白的分泌和转运，降低T3SS的毒力作用[29]。PscF蛋白在T3SS的ExoS和ExoU分泌和转运效应蛋白的过程中发挥着重要作用，苯氧乙酰胺类与PscF蛋白结合后能够持久地降低PA的感染能力。

3.3 黄芩苷群体感应(quorum sensing，QS)是PA的浓度依赖性信号传递调控机制，PA可分泌多种自诱导物，细菌通过感应这些自诱导物来判断周围菌群密度和环境变化，当自诱导物密度达到阈值后，启动调控基因表达和细菌生物学行为[30]。目前发现PA存在3个QS系统，其中包括PA喹诺酮信号分子(Pseudomonasquinolone signal，PQS)介导的QS系统[31]。在PA中，PQS介导的QS系统可通过调控下游转录因子——PQS结合因子(PQS-binding response regulator，PqsR)的转录，进而影响PA的生物膜形成、T3SS的分泌等过程[32-34]。黄芩苷是从植物黄芩的干燥根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，有研究表明，黄芩苷能够通过抑制PqsR转录因子的转录进而抑制T3SS的表达[35-36]。

3.4 磷脂酶抑制剂LEE等[37]通过高通量筛选发现一种针对ExoU的化合物pseudolipasin A,研究表明，该化合物不会影响T3SS的分泌或注射过程，而是通过靶向抑制ExoU的PLA2活性而发挥作用。目前已知的磷脂酶抑制剂有花生四烯酸甲酯等，特异性靶向PA的PLA2的抑制剂研究成果较少，尚需进一步探索。

3.5 磺酰胺衍生物KIM等[38]筛选鉴定了新的ExoU的抑制剂磺胺衍生物。但磺酰胺衍生物的活性并没有pseudolipasin A高。磺酰胺衍生物在结构上呈现多样化，可以作为进一步开发ExoU抑制剂的优选对象，且可以与常见的抗菌药物合用以增强抑菌作用。目前，该化合物正在进一步设计实验中。

4 展望

T3SS及其4种主要的效应蛋白ExoU、ExoS、ExoT和ExoY在PA的感染过程中发挥着关键的毒性作用。尽管近些年来对T3SS及其效应蛋白的研究取得了很多进展，但是对于靶向T3SS及其效应蛋白的抗菌药物的研发仍有很多问题需要解决。靶向T3SS及其效应蛋白的抗菌药物不仅可以降低细菌对抗生素的耐药作用，而且可与常规抗菌药物联用加强抗菌作用[39]。现在靶向T3SS及其效应蛋白的抗菌药物多处于试验阶段，尚未投入临床使用，但新型靶向药物为临床治疗提供了一个新的治疗思路和方法。