猫传染性腹膜炎诊断方法研究进展

魏衍全，韦文娟，何 苗，王芳萍

(甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州730070)

猫传染性腹膜炎(Feline Infectious Peritonitis, FIP)是由猫冠状病毒(Feline Coronavirus, FCoV)引起的一种常见的慢性致死性疾病。一旦猫科动物患上FIP，死亡率极高，而且迄今为止无有效的疫苗可以预防该病，所以及时诊断和对症治疗是非常有必要的。有些动物医院仅使用粪便来检测有无冠状病毒的存在就判断是否患FIP，导致许多猫被误诊。从临床症状上分析，多数患病猫表现为食欲不振、反复发热、自愈性腹泻和眼部炎症，其中湿型FIP占比较高，主要的特征是腹腔积液或者胸腔积液，而干型FIP占比较低，主要的特征表现是神经症状和血管炎。FIP的诊断非常具有挑战性，目前还没有特异性的临床症状或实验室检测方法，诊断时要综合考虑猫的品种、生活史、病史、体格检查、临床症状、影像学检查、血常规检查、RT-PCR检测以及组织病理学检查，其中组织病理学检查可作为FIP诊断的“金标准”。本文就近年来关于FIP的诊断以及S基因的突变分析等研究进展进行综述，通过比较不同诊断方法的特异性和敏感性，总结这些诊断方法的优缺点，为在实际诊疗中采用准确、高效的方法提供参考。

1 猫传染性腹膜炎简况

猫传染性腹膜炎最早报道于1963年，多数学者认为猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis Virus, FIPV)是FCoV的一种生物学表型，而另一表型为猫肠道冠状病毒(Feline Enteric Coronavirus, FECV)。FIPV和FECV都属于α冠状病毒，且很难通过外形、基因组来区分，“体内突变”假说认为，FIPV是由FECV在胃肠道中发生突变而产生，并可引起系统性传播，是本研究领域广泛接受的假说，另外一些学者认为不论是哪种FCoV都可引起猫传染性腹膜炎。流行病学调查发现，在单猫环境中冠状病毒血清阳性率为12%～16%，在多猫环境中为24%～87%，在这其中5%～12%感染FCoV的猫将患上FIP，FIP可以在猫的任何年龄段发病，其中以公猫和纯种猫多发，多数为两岁以下发病。

FIP主要病理特征是化脓性肉芽肿和血管炎，随着疾病的发展，临床表现型可分为湿型FIP(渗出型)和干型FIP(非渗出型)两种，常见的病变部位有肝脏、脾脏、肾脏、浆膜、肠系膜淋巴结、脑部、肺脏、眼睛等。临床显著症状包括呼吸困难、腹水、黄疸、葡萄膜炎，其他症状有顽固性发热、厌食、嗜睡、共济失调和体重减轻。FCoV感染在猫群中非常常见，但是目前通过检测明确区分FIPV和FECV是很困难的，特别是干型FIP的确诊更加具有挑战性。鉴于现在还没有有效的方法治疗FIP，所以能够快速确诊FIP显得至关重要。

2 猫传染性腹膜炎的临床诊断方法

2.1 眼部检查

患FIP猫的中枢神经肉芽肿会引起猫的瞳孔变形、伴有神经症状、前房浑浊并且有纤维素性渗出物沉积，故眼睛出现葡萄膜炎和脉络膜视网膜炎等视网膜病变。因为房水中存在感染FIPV的巨噬细胞，因此利用免疫细胞化学技术可在眼中的巨噬细胞中检测到FIPV抗原。但是猫眼呈现葡萄膜炎在其他非FIPV病例中也很常见，因此仅以眼睛症状不能作为确诊FIP的依据。

2.2 血常规和生化检测

血常规和生化检测多用于宠物医院，FIP患病猫检测后会发现其血液学和生化指标异常，大多数病例检查结果为再生性贫血、淋巴细胞减少和高蛋白血症，这些结果只能提示猫患有感染性疾病，但不能确诊为FIP，所以仅算作一个FIP诊断佐证。有学者指出白蛋白(Albumin)与球蛋白(Globulin)的比值(A:G)可用于评估单个病例中FIP的可能性，当A：G比值<0.4时很可能患有FIP，而A：G比值>0.8时不太可能患FIP。关于A：G比值在FIP诊断中的有效阈值，不同学者观点不尽相同。另一项针对FIP低流行率的猫群调查发现，A：G比值>0.6可排除FIP，但比值<0.6时无法确诊患有FIP，而需要其他诊断依据来确定是否患有FIP。因此笔者认为A:G比值越低，猫患FIP的概率越大。

2.3 影像学检查

采用超声诊断是否有胸腔或腹腔积液，在一项研究中发现32%的FIP患病猫(47/146)经过超声检查发现肾部显示髓质缘征，14%的FIP患病猫(21/146)经过超声检查腹部发现肠系膜淋巴结肿大。通过影像学检查不能最终确诊，阴性结果也不能排除FIP，因此还需进一步的诊断。

2.4 Rivalta实验方法

本方法可以区分腹水为漏出液还是渗出液。将8 mL无菌水与50 μL乙酸混匀后再将新鲜的猫腹水小心地滴加到上述混合液中，若腹水附着在液体表面，保持其形状或缓慢漂浮到底部，则为阳性，若腹水形状消失并与混合液融合则提示为阴性。如果这个试验结果为阴性，那么猫患FIP的可能性不大；如果该试验结果为阳性，也并不代表猫一定患上FIP，这时需要结合其他诊断方法的结果进行综合判断。

3 猫传染性腹膜炎的实验室检测方法

3.1 RT-PCR检测

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术可以检测猫冠状病毒RNA，但是这种方法只能作为诊断的辅助方法之一，并不能确诊，因为RT-PCR一般是利用引物对FCoV基因组高度保守的3’-非翻译区进行扩增，以检测样本中的猫冠状病毒，不能区分FECV和FIPV。

如果RT-PCR能够量化病毒含量，这对于诊断是非常有帮助的，因为感染FIPV的样本不仅更容易检测到FCoV，而且比感染FECV的病毒含量明显更高。因此，一个RT-PCR阳性且病毒含量很高的结果提示猫可能患上FIP。Pedersen N C等通过研究发现，用RT-PCR方法分析大网膜、肠系膜淋巴结和脾脏样品是很好的靶标，因为它们的病毒含量特别高。对血液样本进行RT-PCR分析时，病毒含量很低导致敏感性也偏低，而且检测血液中的病毒RNA并不能确诊为FIP，特异性也不高，所以不建议使用RT-PCR分析血液样本。DoengesS.J.等研究发现，与血液相比，使用RT-PCR检测外周血单个核细胞的敏感性更高。在许多研究中，积液中的病毒含量特别高，特异性很高，而且阳性的RT-PCR结果会更怀疑是FIP，但是感染了FECV的猫也能检测到少量的病毒RNA，即使没有发生FIP，当炎症发生时，FECV可能会从血液中进入积液中，特别是在最近的研究中发现，在没有患FIP的猫渗出液中检测到FCoV RNA。利用RT-PCR方法检测脑脊液中FCoV RNA的特异性为100%，这些研究样本为经过免疫组化等多种检测确诊的猫，至今还没有报道出有假阳性的结果。

FCoV复制和其他RNA病毒一样也容易出错，在病毒复制周期中会发生碱基突变。通过检测FCoV的基因突变可能有助于阐明FIP的发病机制，对FCoV几种不同基因进行分析，找出可能引起基因突变的关键位点。开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)3abc编码非结构蛋白3a、3b和3c，对已患FIP猫和健康猫的FCoV进行测序比较，从患FIP猫的样本中发现FIPV含有一个截断的3c蛋白，而从健康猫的粪便中发现的FECV通常含有一个完整的3c蛋白。FCoV刺突蛋白(S蛋白)介导病毒进入细胞，它包括一个受体结合亚基(S1蛋白)和一个介导膜融合亚基(S2蛋白)。有研究认为FCoV S基因的突变可能是引起病毒的细胞趋向性改变的原因，所以阐明S基因中哪些突变导致FECV转变为FIPV具有重要的意义。

对健康猫的粪便、患FIP的组织或者腹水中的大量FCoV的S基因进行测序发现，患FIP猫的病毒基因组第23531和23537位置存在变异，前者变异导致S蛋白的1058位蛋氨酸被亮氨酸(M1058L)所取代，在23537位核苷酸的变异导致S蛋白第1060位的丝氨酸被丙氨酸(S1060A)取代。2013年也有类似的研究报道，FIPV和FECV的S蛋白在弗林蛋白酶裂解位点有差异。总之，检测各个基因的突变为鉴别FIPV和FECV提供了新的方向，有利于进一步的诊断。

3.2 RT-LAMP检测

环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)是一种新型的分子检测方法，具有快速、简便等优点。Stranieri A等建立了逆转录环介导等温扩增方法检测FCoV，对27只猫的32个样本进行病毒RNA提取和常规RT-PCR，并在RT-PCR扩增片段内设计6个RT-LAMP引物，在63 ℃、1 h的条件下筛选最佳引物。结果显示，建立的新方法总体特异性为100%，但羟基萘酚蓝和琼脂糖凝胶的灵敏度仅达到为54.5%和50%。所以RT-LAMP适合确诊病毒含量高的样品，但不适于排除病毒含量低的样品。但这项技术不需要PCR仪等变温设备，操作简单，特异性强，出结果快速，但存在灵敏度低的缺点。

3.3 组织病理和免疫组化检测

对于难以确诊的病例可以采取侵袭性、创伤性的方法采集样本，然后进行组织病理和免疫组化实验，这是目前国际上公认的FIP诊断的金标准，用于显示受损组织中是否存在病毒，但是检测所需要的时间较长，只能在专业的实验室进行，有时候还会加重病情。有学者将肠系膜淋巴结等组织样品固定后切片，通过免疫细胞化学对组织样品进行染色，再利用病毒抗原与酶标抗体的特异性反应，最后加入底物经过颜色变化来判定结果，但这种方法存在检测灵敏度低的缺点。针对FIP引起的巨噬细胞浸润等组织病理变化做免疫组化试验，敏感性可达到97%～100%。

4 展望

FIP诊断不能仅仅依靠单一方法的诊断结果，重要的是要考虑疑似病例的体征、病史、临床症状和临床病理变化，应根据临床情况结合其他检测结果，特别是能够直接检测病毒RNA的结果。检测猫冠状病毒的抗体对诊断没有帮助，如果发现积液应该做进一步检测分析，对于有神经症状的猫，应该对脑脊液进行分析。

对于有积液的猫应进行实验室分析，通过RT-PCR检测积液有助于确诊，特别是在病毒含量很高的情况下。对于没有明显积液的猫，应该将不同类型的样本合并分析，超声引导穿刺肠系膜淋巴结、脾脏、肝脏等不同器官，并作为RT-PCR的样本材料。如果基因突变在RT-PCR阳性样本中检测到，并且病毒拷贝数很高，那么高度怀疑为FIP。在RT-PCR阴性或缺乏S基因突变的病例中，基于临床症状和其他实验室检测结果FIP的怀疑度仍很高，则必须考虑组织病理切片和免疫组化实验，以便对组织样本做出最终诊断。