营养条件和传代次数对恢复大肠杆菌药物敏感性的影响

代振江，李 达，吕世明，冯文武，李 俊，王维维，梁 萧，任晓慧，张 瑞，何 庆

（1.贵州省绿色食品发展中心，贵州 贵阳 550025；2.贵阳市黔灵山公园动物园，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；4.贵州省种畜禽种质测定中心，贵州 贵阳 550025；5.黔西南布依族苗族自治州册亨县农业农村局，贵州 黔西南布依族苗族自治州 552200）

当前，我国各大养殖场细菌耐药情况非常严重，多重耐药甚至泛耐药菌株不断出现，给养殖业带来了巨大威胁，造成了重大经济损失[1]。2016—2018年，黄丽等在安徽省收集了12 216株非重复菌株，发现耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌分别为74.7%、84.5%、85.3%，表明细菌耐药状况日益严重，多重耐药菌检出率在持续上升[2]。2018年连俊伟对分离自猪场的200株大肠杆菌开展药敏试验，结果表明分离的大肠杆菌对氯霉素、氟苯尼考的耐药率高达90%以上，且存在多重耐药的情况[3]。为探索影响大肠杆菌耐药性的因素，文章对营养条件和传代次数进行了研究，探索其与大肠杆菌耐药性的关系。

1 试验时间、地点与材料

试验于2020年6月至2021年4月在贵州大学动物科学学院进行。试验所用原始菌株为分离自养猪场的对环丙沙星高度耐药的大肠杆菌。环丙沙星、米勒-海顿肉汤和LB肉汤、96孔聚苯乙烯板购自上海盛思生化科技有限公司。

2 方法

2.1 接种物的制备

将试验分为6个组，分别编号为1、2、3、4、5、6，其中第1组的离心管中为正常浓度的LB培养基，2～6组的离心管中分别为稀释2、4、8、16、32倍的LB培养基。将高度耐药的大肠杆菌菌液加入1～6组的离心管中，连续传代培养至210代，将30、60、90、120、150、180、210代的对数生长期菌液用MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，用MH肉汤按1∶100稀释菌液备用。

2.2 MIC板制备

按照100 μL/孔的标准，将MH肉汤加到聚苯乙烯板；将环丙沙星稀释到512 μg/mL，并吸入聚苯乙烯板第1列，100 μL/孔，让第1列每孔中均有肉汤和环丙沙星混合液200 μL，药物浓度保持在256 μg/mL，倍比稀释到第11列，弃掉100 μL，将第12列作为对照组不添加任何药液。最终，聚苯乙烯板中第1～11列每孔含环丙沙星100 μL，浓度分别是256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL。共制7块板，编号1～7，制备好后，冰冻干燥密封，置于-20 ℃备用。

2.3 接种培养

向MIC板1到11列依次加入培养的大肠杆菌100 μL，第12列作为阴性不加菌液，该试验有6组，MIC板的1～6排对应加入1～6组的菌液，此时每孔菌液浓度约为5×105CFU/mL，第1～11列的环丙沙星浓度分别为128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL，1～7块MIC板分别接种30、60、90、120、150、180、210代的对数生长期大肠杆菌菌液，将接种好的MIC板盖好，置于35 ℃培养箱16～20 h。

2.4 试验菌株对抗菌药物敏感性的测定

本试验通过微量肉汤稀释法判定环丙沙星对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC），以美国临床实验室标准化委员会抗菌药物敏感性试验操作标准判定敏感性。

2.5 数据处理

通过SPSS软件处理得出的试验结果。

2.6 结果判断

记录每组完全抑制大肠杆菌的最低抑菌浓度。只有阳性对照孔大肠杆菌显著生长、阴性对照孔无细菌生长时，才能采用试验结果。如果有单一跳孔的情况，应记载抑制细菌生长的最高药物浓度。如若多处出现跳孔，则需进行重复试验。

2.7 结果统计

根据CLSI 2009版推荐的微量肉汤稀释法测得的大肠杆菌分离株对常用2种抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC），按CLSI 2009版推荐的判定标准进行大肠杆菌药物敏感性判定。

3 结果

通过分析表1数据发现，2倍和4倍稀释的培养基对传代培养的大肠杆菌恢复环丙沙星敏感性的影响较小，在稀释8倍、16倍、32倍的培养基中，大肠杆菌对环丙沙星的敏感性恢复较快，传代至150、180代其MIC值降低到接近敏感值，到210代即全部恢复为敏感，表明细菌传代培养的营养条件对恢复大肠杆菌药物敏感性有一定影响性，但培养基稀释倍数与MIC值之间并不存在线性降低的关系，其中培养基稀释16倍时MIC值的估计边际均值最低（图1）。

表1 传代次数和不同浓度培养基对药物敏感性恢复的影响

对培养基稀释8倍、16倍、32倍3组数据进行分析，得出大肠杆菌传代次数与环丙沙星MIC之间存在逆曲线模型关系（图2），不存在线性关系。在培养基稀释8倍、16倍、32倍的条件下，随着传代次数增加，细菌耐环丙沙星MIC值呈逆曲线降低，直至180代、210代降低到敏感范围MIC值0.25 μg/mL。综上所述，耐药大肠杆菌在较低的营养条件下可能恢复对环丙沙星的敏感性。

图2 培养基稀释8、16、32倍传代次数与MIC值曲线

4 讨论

抗生素在动物临床上滥用，使各大养殖场动物细菌耐药性不断攀升，为探索恢复细菌耐药性的方法，本试验用分离自贵州养猪场的对环丙沙星高度耐药大肠杆菌作为试验对象，分别探究了营养条件和传代次数对环丙沙星高度耐药大肠杆菌恢复敏感性的影响，结果显示，对耐药菌进行传代培养能一定程度降低大肠杆菌耐药性，但影响不大；将耐药大肠杆菌在稀释8、16、32倍的营养基中传代培养至210代时，恢复了对环丙沙星的敏感性，表明较低的营养条件能促使大肠杆菌恢复对药物的敏感性。

2019年，秦会玲等发现在母猪舍、妊娠舍、肥育舍、仔猪舍和产房等5个采样点的废水中细菌耐药率较高，在经过处理后的污水池和沉淀废水中细菌耐药率显著下降[4]。推测这可能是由于处理后的污水池和沉淀废水中营养条件相对较低，细菌在这样的环境条件下耐药性不断下降，与本试验结论一致。根据试验结果提示，建议猪场在饲养管理过程中要加强卫生清洁，定期清扫圈舍，加强粪污处理，做好污水排放，破坏细菌的适宜生存环境，促进已经形成的耐药菌逐步恢复药物敏感性。