不同复合支架负载间充质干细胞外泌体应用于骨组织再生的研究进展

欧阳仁俊 综述 杨晓红 审校

1.遵义医科大学口腔医学院，贵州 遵义 563000；2.遵义医科大学附属口腔医院口腔修复科，贵州 遵义 563000

骨骼受损后骨的修复与再生都涉及细胞因子、细胞内外基质的复杂整合[1]，骨质缺损后伴有延迟愈合或不愈合，并发展为较大的骨缺损时，传统的修复手段已不能很好的恢复这一缺损。近年来，外泌体的应用越来越广泛，若采用生物支架材料负载间充质干细胞来源的外泌体可以更好的修复骨缺损，促进骨的修复与再生，获得更好的治疗效果。现就不同复合支架材料负载间充质干细胞外泌体应用于骨组织再生的研究进展予以综述。

1 骨组织缺损与修复

骨是一种高度血管化的器官，骨骼系统受到外界刺激后作出一系列的反应[2]。若骨质缺损后伴有延迟愈合或不愈合，并发展为较大的骨缺损时，传统的修复手段已不能很好的恢复这一缺损。自体骨移植物本质上具有骨传导性和骨诱导性[3]，通常被认为是修复骨缺损的金标准[4]；但它的使用有许多限制，包括供体部位所提供的骨量不足、术后可能导致供体部位出现并发症；受体部位相对较高且难以预测的自体吸收等。于是，异体骨移植成为另一种选择，异体骨移植物依旧保持着骨传导特性，并在一定程度上具有骨诱导性，但它可能成为疾病传播的媒介或细菌感染的载体[5]。若采用诸如生物活性玻璃和陶瓷等材料代替缺损部位实现骨传导，一定程度上能够恢复骨结构和功能，且成本较低，免疫原性小，安全便捷，但是普通生物材料往往缺乏骨诱导活性，对患者自身的骨没有实质性的促进再生作用[2]。

相较于传统的组织修复手段，基于细胞、分子水平的再生技术正在不断改进，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)对组织的修复作用表现在可以在体外诱导刺激分化为实质细胞以替代受损部位，但其存在不可逾越的伦理学问题[6-7]，而MSCs的致瘤性、潜在的疾病传播风险和可能存在的免疫排斥反应阻碍了它在骨组织再生中前进的脚步。外泌体(exosomes，Exos)是细胞通过旁分泌作用产生的一种细胞外囊泡，在细胞间传递生物信号。Exos多为纳米级，呈碟形，直径为40～160 nm。Exos可以为膜蛋白提供天然的膜环境，有助于维持其稳定性和生物活性，从而有助于提高膜蛋白治疗剂的治疗效率[8]。其次，Exos中包含着多种物质，如RNA和蛋白质[9]。它表达亲代细胞类似的功能[10]又可作为纳米载体传递活性因子或小分子物质，在细胞的自分泌和旁分泌信号传导中都起着重要作用。

2 支架材料负载外泌体

生物材料会影响相邻细胞之间的细胞间通讯，从而显著加速组织再生，因为这些囊泡可以从患者的细胞中分离出来，避免了免疫原性对后续治疗的影响，支架作为Exos和其携带生物因子的载体，在极大程度上影响着多种因子的活性。理想情况下，骨支架材料应模仿天然骨细胞外基质的特征和特性，为细胞黏附、迁移、增殖、成骨分化提供适当的生物力学支持和生化环境[4]。良好的支架材料本身应具有(1)“匹配同称”，具有良好的生物相容性，不引起机体免疫排斥和炎症激惹；(2)“刚柔并济”，具有良好的可塑性与一定的机械强度，能为缺损部位的骨组织提供足够支撑；(3)“四通八达”，具有三维多孔结构、合适的孔径大小与高孔隙率；(4)“无毒无害”，具有良好的生物可降解性，其降解产物无毒性，降解速率须与骨再生速率相匹配；(5)“平复如故”，具有骨传导性和骨诱导性，恢复骨缺损部位的结构和功能，能加速骨质沉积、促进骨的生长；(6)“得天独厚”，具有良好的界面微环境，能促进细胞的黏附、增殖与分化；(7)“不拘一格”，来源不受限制，易获得且易消毒。

Exos衍生疗法由于其独特的调节和治疗特性以及非细胞参与而使并发症最小化，其临床转化潜能显而易见[11]，向患有牙周炎的小鼠体内局部注射Exos可显著减轻炎症和修复牙槽骨破坏[12]。利用人脐带沃顿氏胶来源的Exos可增强并促进骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchyml stem cell，BMSCs)的迁移和增殖以及软骨细胞的分化，促进蛋白多糖和胶原蛋白(尤其是Ⅱ型胶原蛋白)的分泌，抑制Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达[13]。

2.1 孔隙率对外泌体释放的影响当机械性能得到满足时，使用高孔隙率值(超过90%)能获得更好的效果，在对大鼠桡骨缺损模型的研究中[14]所采用的聚己内酯(polycaprolactone，PCL)外泌体复合支架，其微孔结构孔径约为250 μm，该结构能够很好的模拟骨小梁构成，利于营养物质和氧气的交换以及新生血管的形成。魏松乔等[15]将丝素与壳聚糖以质量比为5：5的比例混合制备支架，其结构呈现稳定的多孔网状，方便细胞的长入和Exos发挥效能。支架表面孔隙率的高低和微观纳米形态直接影响细胞的功能[16]。骨再生过程需要营养物质，生长因子从外部持续流入支架的核心。介孔生物活性玻璃分级支架的微米级孔隙率为0.5～2 μm，能提供更高的比表面积为Exos负载提供保护，使冷冻干燥的Exos均匀分布在微孔的内表面，并维持其球形颗粒结构和生物活性[17]。CHEN等[18]发现骨关节炎中软骨细胞的线粒体损伤会影响ATP的合成，致使软骨细胞的合成与代谢均受影响。将间充质干细胞衍生的外泌体(mesenchymal stem cells exosomes，MSCs-Exos)与脱细胞软骨和甲基丙烯酸明胶水凝胶复合成生物墨水，通过桌面立体光刻技术进行高分辨率光交联生物材料打印，该复合支架中的Exos可以通过补充线粒体相关蛋白来修复退行性软骨中的线粒体功能障碍和氧化应激损伤；支架则有效增强软骨细胞迁移。

2.2 材料对外泌体释放的影响Exos在复合支架中如何长效保存及释放也是值得研究的热点问题，Exos起源于细胞的多泡分裂，虽具有很高的治疗潜力但随着时间的推移，Exos在缺陷部位的生物活性和稳定性也会发生改变[19]。与Exos的全身给药不同，Exos的局部释放能够带来更好的治疗效果，Mohammadi[20]表示MSCs-Exos受控释放时可以有效预防或延迟宿主对植入物的排斥反应。现有研究证实光敏水凝胶——明胶甲基丙烯酰(Gelatin methacryloyl，GM)水凝胶具有水合3D微环境以及支持细胞黏附的能力，可有效结合和改善生物活性因子并稳定其局部浓度，利用甲基丙烯酰明胶(Gelatin methacryloyl，GelMA)-纳米黏土锂皂石(laponite，LAP)GelMA-LAP水凝胶作为一种新的骨修复策略来改善Exos的局部保留和控制递送[21]，同时水凝胶中的锂皂石可以帮助延缓Exos的释放。若将硫酸软骨素(chondroitin sulfate，OCS)引入GM水凝胶中，GM-OCS水凝胶的双重网络框架可确保Exos的持续释放，其抗炎作用还可以改善局部微环境，促进细胞的合成代谢[22]。水凝胶应用于Exos缓释主要是在非承重区域，羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)具有与天然骨矿物质相似的物理结构，被认为是与水凝胶结合形成骨修复复合支架的理想材料。YANG等[23]将HAP与透明质酸-海藻酸盐水凝胶系统相结合，可在大鼠骨缺损处持久保留Exos并实现受控Exos递送和一定的力学支持。Exos修饰为水凝胶的常用方法是直接混合，其可能存在负载效率低、外泌体结构破坏、阻碍外泌体成骨潜力等缺点。为了克服这些限制，由两条或更多肽链组成的多功能融合肽在药物递送方面表现出优异的能力[24]。融合肽可以增强Exos的保留和稳定性，由小肠黏膜下层和BMSCs-Exos组成的可注射热敏水凝胶，结合带有儿茶酚基团的丙酸改善其力学性能。丙酸使水凝胶变得更加致密，三级结构被整合，儿茶酚基团可以与水凝胶中的胶原分子相互作用，在胶原分子之间形成交联网络，进一步增强水凝胶的力学性能。LI等[25]将外泌体固定于肽修饰的黏合水凝胶上并局部植入，以此实现外泌体的有效保留、释放和整合。聚乳酸-乙醇酸共聚物(Poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA)作为一种可降解的生物共聚物，因其可调节的降解速率和安全地降解副产物而广泛用于控释系统。刘宁[26]通过提取软骨细胞分泌的Exos联合PLGA-HA梯度复合支架，对新西兰大白兔关节软骨损伤进行修复。SUN等[27]开发了一种基于丝素蛋白的冷冻海绵，实现MSCs-Exos的长期稳定释放并维持生物学活性，以及支架降解。外泌体被丝心蛋白链紧紧包裹，并保持了它们的膜完整性，使得外泌体的释放完全依赖于酶促支架的降解。同时体内实验表明，Exos在未消化的海绵材料中可保留两个月之久。SWANSON等[28]将源自人牙髓干细胞的外泌体(human dental pulp stem cells exosomes，hDPSCs-Exos)利用微流体装置封装在聚乳酸-乙醇酸共聚物结合聚乙二醇(poly ethylene glycol，PEG)所形成的三嵌段微球中，并使用聚多巴胺(polydopamine，pDA)进行表面改性以修复小鼠颅骨缺损，hDPSCs-Exos可将内源性细胞募集到缺损处并促进它们的分化，刺激缺损部位骨组织再生。pDA改性后的PLGA支架可以更好的黏附、携带和保留Exos，使Exos可以局部缓慢释放[29]。不同的材料凭借其自身特性影响外泌体作用的效能，选用合适的负载材料可以进一步增强外泌体在骨组织缺损上的治疗效果。

3 支架材料应用于骨组织缺损

3.1 凝胶材料在复合支架中的应用游离在体液中的Exos容易被宿主细胞吞噬而无法发生效应[30]，这会限制Exos本身的作用，采用诸如透明质酸、壳聚糖和聚乙二醇这类生物医学水凝胶则可以在一定程度上解决这一问题，水凝胶凭借其优越的生物相容性、生物降解性、封装能力和三维多孔结构得到广泛应用。透明质酸钠保湿能力卓绝，在组织损伤和组织修复方面发挥着重要作用。透明质酸水凝胶可起到了良好的载体作用，将脐带来源的Exos封装于水凝胶内，并植入缺损部位，可促进细胞的增殖、迁移和血管生成[31]；将牙髓干细胞来源的Exos负载于壳聚糖水凝胶中并局部注射至小鼠体内，则可缓解其牙周炎的快速进展[32]；使用水凝胶材料搭载脂肪来源的间充质干细胞外泌体(adipose-derived mesenchymal stem cells exosomes，AMSCs-Exos)可促进骨再生[33]并获得更好的治疗效果[34]。明胶水凝胶和纤维蛋白交联改性后可获得良好的三维空间结构，以此延长Exos作用的时间，更好地促进牙髓细胞的组织再生[35]。可注射黏附性多功能多糖基敷料[36]以温敏性、可注射性、自愈性和黏附性的多糖基水凝胶支架作为基础，负载AMSCs-Exos，能促进细胞快速增殖、肉芽组织形成、胶原沉积、重塑和再上皮化。源自诱导多能干细胞的MSCs所分泌的Exos可以促进卵巢切除术后大鼠颅骨缺损处的骨再生和血管生成，其对骨增殖的促进效果随着Exos浓度的增加而增加[37]。壳聚糖-明胶-硫酸软骨素冷冻凝胶支架[38]中壳聚糖是糖胺聚糖的类似物，已被证明可促进人类软骨细胞的生长，而明胶作为水解胶原蛋白，可帮助细胞附着。两者均可以自凝胶化，进一步增强支架稳定性。

3.2 聚己内酯在复合支架中的应用聚己内酯(polycaprolactone，PCL)是一种具有良好生物相容性和降解性的高分子有机聚合物，在组织缺损修复中可作为良好的支撑材料，具有出色的韧性和机械强度[39]。负载阿司匹林的脂质体与骨形成肽-1组合后并结合在PCL支架上，可以刺激MSCs的成骨分化，还可以协同促进新骨的形成[40]。若将PCL与Exos结合使用，会带来更好的修复效果，通过结合S-亚硝基谷胱甘肽(S-Nitrosoglutathione，GSNO)和MSCs-Exos[41]，构建具有免疫调节潜力的PCL支架，可显着减轻巨噬细胞刺激的炎症并在一定程度上加速了MSCs的成骨分化。但PCL支架相对生物惰性，导致治疗效果不理想；浓度为2.5 μg/mL的银纳米颗粒可通过自噬调节增加MSCs的成骨分化和矿化[42]，银纳米颗粒的胶原蛋白支架可以促进骨再生并诱导体内骨折间隙的早期闭合[43]，低剂量的银纳米颗粒结合PCL支架可以增强BMSCs的成骨分化。

3.3 钛合金材料在复合支架中的应用钛及钛合金[44]凭借自身良好的生物相容性和机械性能，在临床种植材料中脱颖而出，成为应用最广泛的硬组织支架之一[45]。将透明质酸钠、海藻酸钠凝胶分别制备成水凝胶负载Exos，并配合高强度的钛合金材料以修复骨缺损可以取得良好的效果[46]，用骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)刺激巨噬细胞后获得外泌体与单尺寸的钛纳米管进行整合，与骨质疏松患者的BMSCs共培养后发现，该BMSCs的碱性磷酸酶和BMP2的表达显著增强，可有效促进BMSCs的成骨能力[47]。通过支架负载Exos以增强软骨细胞的增殖和迁移。先前许多的体外和体内研究表明，钛合金可以促进成骨和骨整合[48]，且具有更高的弹性模量和生物惰性，但单纯使用钛合金作为植入物可能会导致应力屏蔽和骨植入物界面效应，导致骨吸收和纤维组织包封。有研究指出，Exos与多孔钛合金结合可以有效提高钛合金支架在骨修复中的功效[49]。随着3D打印技术的发展，可以制备具有精确空间构型的多孔钛(porous Ti，pTi)合金。一方面，植入物可以与缺损部位完美匹配。另一方面，合适的多孔结构可以有效促进骨组织向内生长，从而增加植入物的骨结合。最重要的是，多孔结构可以有效降低钛基合金的弹性模量，减少应力屏蔽。WU等[49]使用(710±42)mm的大孔径和(68±5.3)%的孔隙率来促进体内成骨和骨整合，用镁和羟基磷灰石对钛合金进行表面改性可有效提高钛合金的生物活性。将雪旺细胞衍生的外泌体均匀掺杂到人工基底膜中，将此膜注入多孔pTi支架的孔隙中可以有效提高钛合金的生物活性。

4 展望

Exos复合支架的应用为骨组织修复和再生带来新的启示，其与组织损伤后相关的抗炎和促炎息息相关，然而，负载间充质干细胞外泌体的复合支架材料其实际临床应用仍然存在许多障碍。例如，支架材料与Exos如何更好的结合，复合支架在体内所处的环境如何影响Exos的效能，复合支架如何做到极速释放或缓慢释放，释放量的可控性和释放部位的选择性都是亟待解决的问题，其次Exos修复和再生背后的分子机制尚未完全阐明，更值得深入探究。本课题组致力于颌骨骨髓间充质干细胞和肿瘤来源外泌体方面的研究。前期研究发现颌骨来源的BMSCs具有更高增殖特性，通过对颌骨来源的BMSCs的miRNAs表达谱筛选、验证和miRNAs调控机制的探讨，发现引起颌骨骨髓间充质干细胞的miRNAs差异性表达的原因是关键免疫因子发生了改变，进而导致了miRNAs前体的成熟，影响了miRNAs的差异性表达，另一方面，课题组发现Exos在肿瘤的发生发展、转移等方面具有促进作用。课题组将在试验基础上进一步研究负载颌骨来源的BMSCs-Exos支架材料的生物学性能及其表征，以及其对骨缺损的修复作用。总体而言，对生物材料负载Exos修复骨缺损的研究，将为再生医学中的无细胞治疗提供更多新思路和新见解。