低氧诱导因子-1α在颌骨缺损重建修复中的应用及研究进展*

李舒雅 陈京京 刘腾达 王淑红

由各种原因造成的颌骨缺损修复是口腔颌面外科领域亟待解决的重点课题。从临床效果来看，自体骨移植仍是“金标准”，但存在供区组织有限、二次创伤、增加费用及患者不适等缺点；异体骨虽来源充足，但有免疫源性及病原体感染的潜在可能性。上世纪中期以来，人工合成材料迅速发展，但缺乏良好的骨诱导和骨引导性，只能完成外形和结构修复，与真正的功能重建相去甚远。

骨组织缺损真正的功能重建包括成骨和血管形成两个密不可分的过程，颌骨缺损区的低氧状态显著刺激血管发生，而HIF-1α 是在低氧条件下的一个不可或缺氧依赖转录激活因子，一方面可促进血管内皮生长因子VEGF 等表达诱导血管形成，另一方面可影响成骨细胞等骨系细胞的功能，调控骨形成及骨改建。本文总结HIF-1α 对各类骨细胞及骨血管的调节，以及其在骨组织工程、骨折、牙周炎、牵张成骨等作用及应用，为讨论HIF-1α 对颌骨缺损的修复重建提供参考。

1.HIF⁃1α的基本结构及生物特性

低氧诱导因子-1(HIF-1）是由Semenza［1］最早在1992年从缺氧的肝癌细胞株中发现的一种蛋白，由一个分子量为120 000 的α 亚基和一个分子量为91～94 000的β 亚基构成，其中HIF-1α 亚基由826个氨基酸构成,对HIF-1 活性起主要决定作用。常氧状态下，HIF-1α 被脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase,PHD）羟基化，进而被Von Hippel-Lindau 蛋白（VHL）识别后泛素化，从而被蛋白酶降解［2］。而在低氧状态下，PHD 活性降低且HIF-1α 羟基化被扼制，HIF-1α 在细胞内蓄积，与HIF-1β 形成二聚体，并进入细胞核与调节区的缺氧反应元件（HRE）结合，激活下游相关靶基因，进而诱导组织细胞发生缺氧适应性反应。当氧浓度降至5% 以下时，PHD 活性降低，HIF-1α 稳定，并参与下游靶基因的表达［3］。研究表明，在氧浓度为5%时，HIF-1α 表达上调，但显著低于HIF-2α；在氧浓度为1%时，HIF-1α 及HIF-2α 表达均上调［4］。刘晓东等实验中，在2%低氧浓度下，HIF-1α 表达升高，促进成骨细胞增值矿化［5］。

2.HIF⁃1α在颌骨改建中的作用机制

2.1 调节骨代谢

2.1.1 调节成骨细胞作用 成骨细胞是参与骨形成及改建的关键功能细胞，HIF-1α 可以调控其增殖和迁移，且其调控因氧浓度的高低可发挥不同的作用。常氧状态下,增强HIF-1α 表达可以促进成骨细胞增殖，增强新生骨形成；沉默HIF-1α则抑制其活性和增殖，抑制成骨标志物的表达，包括Runt 相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2）及骨钙素和碱性磷酸酶（Alanine phosphatase,ALP)。

低氧状态下，HIF-1α 表达增加，成骨细胞活性随之降低。Xu等［6］研究表明，低氧状态下，MC3T3-E1 细胞活性减弱，但HIF-1α 蛋白表达升高，HIF-1α 的上调表达可通过抑制细胞凋亡来拮抗低氧诱导的成骨细胞活性的减弱。还有研究表明，HIF-1α 的上调表达能够促进MC3T3-E1细胞的成骨能力和丙酮酸脱氢酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase 1,PDK1）的 表达［7］。HIF-1α 可通过对VEGF、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、VHL 以及miRNA-497～195簇等的调控作用进而调节成骨细胞生成［8-10］。

2.1.2 调节破骨细胞作用HIF-1α 可通过骨保护素（OPG)/细胞核因子-κB 受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)/细胞核因子-κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)、蛋白酪氨酸激酶2(janus kinase 2,JAK2)/信号转导和转录激活因子3(signal transduction and transcription activator 3,STAT3）等多种信号通路直接或者间接作用于破骨细胞。RANK 与RANKL 结合可刺激破骨细胞分化进而加速骨质吸收，然而OPG 可与RANKL 发生竞争性结合，抑制该过程。Zhu等［11］研究表明，HIF-1α 可通过JAK2/STAT3通路来推动RANKL 的表达并刺激破骨细胞分化。Song等［12］研究则发现HIF-1α 通过激活JNK/caspase-3通路起到了促凋亡因子的作用。此外，Kang［13］等研究表明，白细胞介素-33(IL-33）在抑制破骨细胞生成中发挥作用。HIF-1α 激活可导致IL-33 表达增加，IL-33 通过miR-34a-5p-Notch1 途径作用于骨髓来源的单核细胞以减少其在破骨细胞中的分化。

2.1.3 调节软骨细胞作用HIF-1α在软骨稳态中起重要作用，可增强细胞外基质合成和抑制细胞凋亡［14］。在低氧环境下，HIF-1α可抑制终板软骨细胞凋亡，HIF-1α通过调节p300结合蛋白CITED2启动子表达，抑制VEGF条件细胞降低，从而增加细胞在低氧中的存活率［15］。HIF-1α参与软骨形成及软骨成骨，可加强间充质干细胞向软骨方向分化。有学者发现，HIF-1α可激活SOX9促进软骨细胞外基质的合成［16］。还有研究表明软骨与成骨细胞共培养可激活软骨细胞的细胞外信号调节激酶（Extracellular signal-regulated kinase,ERK)1/2和p38信号，上调HIF-1α表达［17］。

2.1.4 调节间充质干细胞作用 间充质干细胞属于多能干细胞，在较理想的微环境下可分化为成骨细胞、软骨细胞等多种细胞。Costa等［18］研究表明miRNA-675-5P 可通过HIF-1α 促进间充质干细胞成骨分化。Xu 等通过研究则得出HIF-1α介导的基质细胞衍生因子-1 可对间充质干细胞发挥作用［19］。Chen等［20］研究发现FG4592（HIF-1α脯氨酰羟化酶的强效抑制剂）通过HIF/Ca2+/NO/活性氧（reactive oxygen species,ROS）通路增强骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的增殖迁移，继而加快骨缺损的愈合。Zhang等［14］研究表明HIF-1α 蛋白可增强BMSCs 的活力，使骨缺损区BMSCs 的数量保持在较高水平，从而提高BMSCs的骨愈合能力。

2.2 调节骨血管作用 在骨的生长发育中，充分地血管化至关重要。血管生成不仅能为骨形成和改建提供养分，也能提供其所必需的氧，血管生成与骨组织生长改建紧密相连。有研究表明，在缺乏功能性和充分血管网络的情况下，骨组织将发生坏死和骨形成失败。血管生成和成骨之间的关键相互作用，影响了损伤后的骨再生。HIF-1是一种广泛表达的转录因子，迄今为止已确定100 多个HIF-1 靶基因，VEGF 是其中之一。有研究显示，HIF-1α 不足的小鼠小梁骨体积显著减少。耦合骨生长和血管生成的关键机制是激活HIF-1α 通路，该通路在缺氧条件下增加成骨细胞中VEGF 的表达。研究表明，成骨细胞衍生的VEGF 作用于邻近的内皮细胞（ECs)，介导血管生成效应并维持血管完整性；因此，ECs 分泌由HIF-1 介导的VEGF也能促进血管生成和成骨，防止骨丢失。HIF-1α还可通过调节OASIS 蛋白、miRNA-675-5p 等来对影响骨血管的形成产生影响。OASIS 缺乏导致骨发育过程中血管化不完善，发育不完善的血管无法为成骨细胞提供足够的营养，以发育小梁骨，从而形成脆弱的骨骼系统。OASIS-HIF-1α 复合物可能改善骨形成、伤口愈合和颗粒组织形成过程中的血管生成［21］。在低氧条件下，miR-675-5p 参与缺氧介导的BMSCs细胞血管生成［18］。

3.HIF⁃1α在颌骨修复中的应用

3.1 骨组织工程 是将自体干细胞在体外诱导、扩增、培养，形成种子细胞并接种于细胞支架上植入骨缺损区，以促进骨的修复［22］。考虑到天然骨的结构复杂性和当前治疗方案的局限性，设计一种仿生和功能性组织工程骨移植物已成为骨缺损功能重建的迫切需要。研究表明低水平激光治疗（low level laser therapy,LLLT）通过ROS/HIF-1α 通路结合血管生成和成骨来增强血管化骨再生。LLLT触发了HIF-1α，VEGF 和TGF-β的ROS依赖性增加，并导致随后形成H型血管和间充质干细胞的成骨分化［23］。Cheng等［24］实验证明HIF-1α 过表达BMSCs 联合胶原蛋白支架（collagen scaffolds,COL）移植促进颞下颌关节髁突骨软骨缺损兔的髁突软骨修复并抑制软骨下骨硬化。由此表明，HIF-1α 的发现及骨组织工程的发展对颌骨缺损修复提供了新方向且取得一定成果。

3.2 骨折愈合 骨折愈合是骨的一种再生修复反应，主要包括以下三个时期：血肿机化期、纤维骨痂形成期、骨性骨痂形成期［25］。骨折会造成局部骨组织缺氧，缺氧引起HIF-1α 在体内蓄积，HIF-1α 可通过多种骨细胞适应缺氧环境来参与骨折的愈合。在血肿机化期，HIF-1α 可诱导血管生成，HIF-1α 通过刺激VEGF 来调控骨内血管生成；纤维骨痂形成期，HIF-1α 可局部聚集大量骨细胞，产生骨痂；骨性骨痂形成期，HIF-1α 可调控成骨及破骨细胞的偶联代谢来影响骨愈合。骨折后所形成的缺氧环境会激活HIF-1α，促进BMSCs 向成骨细胞分化［26］；还可通过SOX9 基因的表达来影响软骨生成［27］。HIF/Wnt 通路也可调控BMSCs 分化，抑制成骨细胞凋亡，促进其成骨能力［6］。赵建指出，去铁胺（desferrioxamine,DFO）可与Fe2+之间的作用抑制PHD 活性，从而造成HIF-1α 蓄积，在卵巢切除小鼠骨折模型中，局部应用DFO，促进新生血管生成及新骨形成，加速了骨折的愈合［28］。以上结果表明HIF-1α 在骨折修复中起重要作用。

3.3 牙周炎 牙周炎是牙齿支持组织的一种慢性炎性疾病。在各类研究中表明，HIF-1α 有促炎作用，可诱导牙周膜细胞自噬和凋亡，还可影响牙周炎的进展及愈后。低氧微环境中升高的HIF-1α 可进一步激活p53 表达，进而抑制牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）增殖并促进其凋亡［29］。Xu等［30］发现缺氧可以通过HIF-1α 诱导的VEGF 在PDLSCs 和牙周组织中调节RUNX2 的表达，可增强缺氧牙周组织的成骨作用，HIF-1α 在PDLSCs 早期成骨过程中具有积极作用。Chen等［31］研究证明，二甲基草甘氨酸（dimethyloxalyglycine,DMOG）在常氧条件下激活HIF-1α 可能激活VEGF 并促进牙周炎的骨形成，减少牙周炎中的骨吸收。Cui［32］等有关Ti3C2Tx的牙周再生实验中得出，Ti3C2Tx可通过HIF-1α/Wnt 信号通路促进PDLSCs 成骨分化，进而修复牙周缺损。以上可以得出HIF-1α在牙周炎的生理病理过程的重要作用。

3.4 牵张成骨 是通过将骨量不足的区域进行骨切开，经过延迟期后，以牵张器缓慢牵张骨骼间隙，使其增宽，并激发机体组织的再生潜力，从而使术区骨组织及周围的肌肉、神经等组织新生、延长，使其达到修复骨缺损的目的。HIF-1α 在此牵张时间段内可促进新骨形成。Xu等［33］通过研究手风琴技术对大鼠牵张成骨模型骨再生的影响得出，手风琴技术在牵张成骨期间通过激活HIF-1α/VEGF 有效地促进骨巩固。研究表明，缺乏VHL小鼠在牵张成骨结束时可观察到血管增加，骨形成增加，抑制HIF-1α 则血管数量减少、骨再生减少，此结果证明可通过HIF 途径的激活促进血管生成及骨再生。Wan 等指出在成骨细胞中缺乏VHL且具有组成型HIF-1α 激活的小鼠血管生成显着增加，并产生更多的骨组织以响应牵张成骨，而缺乏HIF-1α 的小鼠则破坏了血管生成和骨愈合［34］。Hamushan等［35］研究结果表明高纯镁组VEGF 和HIF-1α 高度表达，该组骨体积/组织总体积、骨密度、新愈伤组织力学性能均显著高于不锈钢组和对照组，高纯度镁植入物具有增强牵引成骨血管生成和骨巩固的潜力。这些都证实了HIF-1α 在牵张成骨修复中的重要作用且成为临床治疗中的一个重要靶点。

4.小结与展望

HIF-1α 通过对成骨、破骨、软骨及间充质干细胞还有骨血管形成的调节在颌骨缺损修复中起重要作用，HIF-1α 不仅促进骨折骨缺损修复，还参与牙周炎、牵张成骨等口腔骨组织的改建。之前有关HIF-1α 的研究多在成骨细胞及血管生成方面，近年来HIF-1α 在破骨细胞、软骨细胞及间充质干细胞调控中的研究取得很大进展，但其调控具体机制还有待更深入研究。随着HIF-1α 及低氧调控机制的研究，HIF-1α 介导及低氧相关治疗日益增多，DFO 及DMOG 等药用低氧模拟化合物的研发逐渐成为热点［34-36］，这类化合物可激活HIF-1α 通路增强成骨分化及血管生成。但也有一些研究表明，HIF-1α 存在过表达、生成的骨质结构欠佳、骨硬化症甚至造成骨瘤生成等问题［37］，有学者指出，PHD1、PHD2 和PHD3 的联合失活导致极端 HIF 信号传导，会造成过度刺激血管生成-成骨耦合导致过度骨积累。但同时指出，PHD2 和PHD3 的联合基因失活导致适度的HIF靶基因激活和骨小梁体积的适度增加，不会造成骨质流失［3］。这又为临床上预防骨硬化症，避免新骨过度形成、骨质量欠佳提供了新思路。