PI3K/SGK1信号通路上调小鼠肺上皮钠通道表达的研究*

马 青， 李长毅， 王导新， 邓 旺

（重庆医科大学附属第二医院呼吸内科，重庆 400010）

上皮钠通道（epithelial sodium channel，ENaC）是肺泡腔内钠水转运的重要环节，能有效地清除聚集的水肿液，对维持气体交换和改善氧合至关重要，可明显降低急性肺损伤（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）患者的病死率［1］。磷酯酰肌醇3-激酶（phos‑phatidylinositol 3-kinase，PI3K）是参与调节ALI 肺泡液体清除（alveolar fluid clearance，AFC）的重要信号通路，但其下游的作用靶点及与ENaC 的关系仍未完全阐明清楚［2］。血清-糖皮质激素调节激酶1（serumglucocorticoid regulated kinase 1，SGK1）是胰岛素激活PI3K 通路发挥效应的下游重要靶点，也是调节ENaC 表达的关键因子［3］。本研究通过建立小鼠ALI模型，观察PI3K/SGK1信号通路对AFC 及ENaC 表达的影响，探讨PI3K/SGK1信号通路在ALI中的作用。

材料和方法

1 实验材料

SPF 级雄性C3H/HeN 小鼠24 只（7～9 周，体重为20～24 g）购自重庆医科大学动物实验中心［生产许可证号为SCXK（渝）2007-0001］。脂多糖（lipopolysac‑charide，LPS；O111：B4）和伊文思蓝（Evans blue）购自Sigma；重组人胰岛素购自EliLilly；PI3K p85α小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）购自Santa Cruz；SGK1siRNA 由Gene Pharma 设计并合成；ENaC α亚基（α-ENaC）、ENaC β亚基（β-ENaC）、ENaC γ亚基（γ-ENaC）、PI3K p85α、SGK1、磷酸化SGK1（Ser422）及β-actin 单克隆抗体购自Santa Cruz；RNA 提取试剂盒和RT-PCR 试剂盒购自TaKaRa；Lipofectamine®2000转染试剂购自Invitrogen。

2 实验方法

2.1 动物模型与分组小鼠给予巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉后，分离暴露颈静脉，留置静脉导管，气道内滴入LPS（5 mg/kg）建立ALI 模型［4］。24 只小鼠随机分为对照组、ALI 组、胰岛素组和PI3KsiRNA组，每组6 只小鼠。对照组：经颈静脉泵入等体积的生理盐水；ALI 组：给予LPS 建立ALI 模型后，持续泵入等体积的生理盐水；胰岛素组：给予LPS 建立ALI模型后，持续经颈静脉泵入胰岛素（0.1 U·kg−1·h−1）［5］；PI3KsiRNA 组：建立ALI 模型，持续泵入胰岛素（0.1 U·kg−1·h−1）的同时，100 μgPI3K p85αsiRNA稀释于100 μL生理盐水中通过移液管直接导入小鼠喉咙，立即闭合小鼠气道［6］。对照组、ALI 组和胰岛素组中以同样方式给予等量的空白siRNA 作为参照。8 h后处死小鼠，收集肺组织标本。

2.2 细胞培养与转染小鼠原代肺泡上皮II 型细胞的分离培养参照文献［7］进行。 依据Lipo‑fectamine®2000 转染的要求，细胞分别转染PI3KsiRNA 和SGK1siRNA。转染72 h 后，细胞于含或不含200 mU/L 胰岛素的培养液中培养2 h。细胞分组：对照组（无胰岛素）、胰岛素组、PI3KsiRNA（胰岛素+PI3K p85αsiRNA）组和SGK1siRNA（胰岛素+SGK1siRNA）组。

2.3 支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）收集小鼠麻醉后，打开胸腔，用腰麻导管做气管置管，用1 mL 生理盐水行支气管肺泡灌洗，共3次，回收率达80%～90%。将收集的BALF 取少许置于白细胞计算盘进行细胞计数，在高倍镜下计数除上皮细胞及红细胞外的所有细胞。BALF以14 000×g离心10 min后沉淀的细胞再加1 mL RPMI-1640细胞培养液，摇匀后取20 μL做细胞计数，最终取4×104个细胞用Diff-Quik染色，观察总细胞数和中性粒细胞数。

2.4 AFC 测定游离右肺组织并行气管插管，注入100% 氮气后，将含0.15 g/L Evans blue 标记的5% 白蛋白等渗生理盐水（5 mL/kg）经导管灌入小鼠肺组织，机械通气1 h 后测定肺泡腔内Evans blue 标记的白蛋白浓度，根据公式计算：AFC（%）=（Vi−Vf）/Vi×100%，Vf=Vi×Pi/Pf［8］。Vi：起始注入肺泡内液体量；Vf：最后肺泡内液体量；Pi：起始注入的Evans blue 标记的白蛋白浓度；Pf：最后Evans blue 标记的白蛋白浓度。

2.5 免疫荧光实验小鼠肺组织10% 福尔马林固定，石蜡包埋切片，厚度5 μm。10% 胎牛血清水浴箱封闭1 h 后，PBS 洗净3次后，分别与α-ENaC、β‑ENaC 和γ-ENaC Ⅰ抗4 ℃冰箱孵育过夜。PBS 冲洗3 次，再与荧光标记Ⅱ抗（Alexa Fluor 594 goat anti‑rabbit IgG）37 ℃水浴箱孵育1 h，PBS 冲洗3次。加DAPI 染核，PBS 冲洗3 次，甘油封片，荧光显微镜下观察拍照。

2.6 RT-PCR 实验提取细胞总RNA，根据RT-PCR试剂盒要求，进行逆转录合成cDNA。PCR 条件：预变性94 ℃1 min；变性94 ℃30 s，退火53 ℃（α -ENaC）、53 ℃（β-ENaC）、55 ℃（γ-ENaC）和55 ℃（βactin）30 s，72 ℃1 min，30 个循环。PCR 引物序列如下：α-ENaC 的上游引物为5'-TACCCTTCCAAG‑TATACACAGC-3'，下游引物为5'-CAGAAGGAGA‑CTCCGAATTAGT-3'，产物509 bp；β-ENaC 的上游引物为5'-GCTAAAGAGCTAGCAGTAATGG-3'，下游引物为5'-CTGGTGTTTGTTATGCCTAGAG-3'，产物406 bp；γ-ENaC 的上游引物为5'-GGATCCTGAGAGAGA‑ATCATGC-3'，下游引物为5'-GTGTCCAGCTAT‑GCCCTTTAAC-3'，产物363 bp；β-actin的上游引物为5'-GTACAACCTTCTTGCAGCTCCT-3'，下游引物为5'-ACAGGATTCCATACCCAGGAAG-3'，产物871 bp。PCR 产物在1.0% 琼脂糖上进行凝胶电泳。Quantity One 软件分析目的条带密度，以目的条带与β-actin比值作为结果进行比较。

2.7 Western blot 实验提取细胞膜蛋白，经10%SDS-PAGE 分离后，转移至硝酸纤维素膜上。5% 脱脂奶粉封闭1 h 后，分别与抗体（α-ENaC 和γ-ENaC，1∶300；β‑ENaC、SGK1 和磷酸化SGK1，1∶500；PI3K p85α，1∶1 000；β-actin，1∶2 500）4 ℃孵育过夜。用Tris 缓冲液+Tween 20（TBST）洗膜3 遍，然后加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗室温孵育1.5 h，ECL 显色。凝胶成像系统扫描，Quantity One 软件分析目的条带吸光度（A）值，以目的条带与β-actin比值作为结果进行分析。

3 统计学处理

用SPSS 16.0 统计软件分析处理结果。所有计量数据均以均数±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较采用单因素方差分析及LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 BALF中细胞总数和中性粒细胞数变化

与对照组比较，ALI 组BALF 中细胞总数和中性粒细胞数显著增加（P<0.05）；与ALI 组比较，胰岛素组BALF 中细胞总数和中性粒细胞数显著降低（P<0.05）；与胰岛素组比较，PI3KsiRNA干预后BALF中细胞总数和中性粒细胞数显著升高（P<0.05），见表1。

表1 BALF中细胞总数和中性粒细胞数变化Table 1.Numbers of total cells and neutrophils in BALF（×104 L−1.Mean±SD. n=6）

2 AFC情况

与对照组比较，模型组AFC显著降低（P<0.05）；胰岛素治疗后，AFC 显著提高（P<0.05）；PI3KsiRNA干预后，AFC 较胰岛素组显著降低（P<0.05），见图1。

Figure 1.Changes of alveolar fluid clearance in each group.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs ALI group；△P<0.05 vs insulin group.图1 各组肺泡液体清除率变化情况

3 免疫荧光染色检测肺组织ENaC蛋白表达

与对照组比较，ALI 组α-ENaC、β-ENaC 和γ-ENaC 的表达减少；胰岛素组α-ENaC、β-ENaC 和γ-ENaC 的表达增加；PI3KsiRNA 干预后α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC的表达减少，见图2。

4 肺泡上皮细胞ENaC mRNA表达

与胰岛素组比较，PI3KsiRNA 组中α-ENaC、β-ENaC 和γ-ENaC 的mRNA 表达显著降低（P<0.05）；与胰岛素组比较，SGK1siRNA 组中α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC 的mRNA 表达显著降低（P<0.05），见图3及表2。

5 肺泡上皮细胞ENaC蛋白表达

与胰岛素组比较，PI3KsiRNA 组中α-ENaC、β-ENaC 和γ-ENaC 的蛋白表达显著降低（P<0.05）；与胰岛素组比较，SGK1siRNA 组中α-ENaC、β-ENaC 和γ -ENaC 的蛋白表达显著降低（P<0.05），见图4及表2。

表2 各组肺泡上皮钠通道的表达Table 2.Expression of ENaC in each group（Mean±SD. n=6）

6 肺泡上皮细胞SGK1磷酸化水平

与对照组比较，胰岛素组SGK1磷酸化水平显著升高（P<0.05）；与胰岛素组比较，PI3KsiRNA 干预后SGK1磷酸化水平显著降低（P<0.05）；与胰岛素组比较，SGK1siRNA 干预后SGK1 磷酸化水平显著降低（P<0.05），见图5。

讨 论

Figure 2.The expression of ENaC in lung tissues of each group detected by immunofluorescence staining.The scale bar=50 μm.图2 免疫荧光染色检测各组肺组织ENaC表达

Figure 3.The mRNA levels of α-，β- and γ-ENaC in alveolar epithelial cells of each group detected by RT-PCR.图3 RT-PCR 检测各组肺泡上皮细胞中ENaC 的mRNA 表达水平

Figure 4.The protein levels of α-，β- and γ-ENaC in alveolar epithelial cells of each group detected by Western blot.图4 Western blot 检测各组肺泡上皮细胞中ENaC 的蛋白表达水平

ALI/ARDS 由于多种肺内外病因导致肺泡-微血管屏障结构破坏，肺微血管通透性增高，从而肺泡腔内富含蛋白质的大量水肿液聚集及透明膜形成，导致呼吸窘迫及顽固性低氧血症，近10 年住院死亡率达45%［9-10］。LPS 通过激活大量的促炎症因子启动NF-κB 转录因子，释放炎症介质，大量中性粒细胞聚集，释放活性氧，引起肺泡上皮-毛细血管屏障损伤和渗漏，引起肺水肿，是模拟ALI/ARDS 的常用方法［11］。本研究中通过LPS 建立小鼠ALI 模型，ALI 模型组中BALF 的总粒细胞数和中细胞数显著增加，AFC 降低，提示肺泡-微血管屏障破坏及炎症因子聚集，与人的ALI/ARDS病理生理表现相似。

Figure 5.The phosphorylation of SGK1 in alveolar epithelial cells detected by Western blot.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs insulin group.图5 肺泡上皮细胞SGK1磷酸化水平

SGK1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其激活依赖于羧基末端疏水基序中Ser422 通过胰岛素作用PI3K信号通路的磷酸化实现［12］。本实验中胰岛素作为激活PI3K/SGK1 通路的有效途径，同时还具有抗炎作用［13］。本实验中胰岛素的剂量不会引起血糖的较大差异的变化，这在前期研究中已经得到证实［5］。在胰岛素作用后，炎症细胞的渗出减少，AFC 增加，肺组织损伤减少。PI3KsiRNA 干预后，明显抑制了胰岛素引起的保护效应，炎症细胞渗出显著增加，说明胰岛素激活的PI3K信号通路减轻LPS诱导的肺损伤，保护了小鼠肺组织。

AFC 被认为是排除肺泡腔内过多水肿液的有效途径［14-15］。本研究中PI3KsiRNA 干预后，AFC 也较胰岛素组显著降低，提示PI3K 信号通路能有效促进AFC，减轻肺水肿。肺泡ENaC 是肺泡腔内钠离子跨膜转运，完成钠水转运过程的限速步骤，为排除肺泡腔内过多的水肿液提供源动力，是调节AFC 的最重要途径和治疗肺水肿的一个靶点［16-17］。ENaC 由α、β和γ 3 个亚基组成，主要表达于肺泡上皮II 型细胞。研究表明，α-ENaC、β-ENaC和γ-ENaC是AFC中必不可少的通道蛋白［18-19］。本研究结果显示LPS 诱导的ALI 模型组中，α-、β-和γ-ENaC 蛋白的表达显著下降，而胰岛素治疗后能显著上调α-、β-和γ-ENaC 的蛋白表达，同时PI3K siRNA 干预后，α-、β-和γ-ENaC蛋白的表达显著下降，其变化与AFC 一致，提示胰岛素激活PI3K 信号通路与ENaC 介导的AFC 存在联系。为进一步探讨参与AFC 调节的PI3K 信号通路下游的作用靶点，我们进行了体外实验，结果显示，胰岛素干预后，α-、β-和γ-ENaC mRNA 和蛋白表达显著增加，其变化与胰岛素诱导的SGK1磷酸化水平升高一致。PI3KsiRNA 和SGK1siRNA 分别干预后，α-、β-和γ-ENaC 的mRNA 和蛋白表达显著降低，其变化与SGK1 磷酸化水平降低一致，说明α-、β-和γ-ENaC 表达的变化是通过PI3K/SGK1 信号通路实现的，与AFC 变化趋势一致。 这证明了激活PI3K/SGK1 信号通路通过上调ENaC 各亚基的表达，从而促进AFC，减轻肺水肿，保护小鼠肺组织。本研究结果揭示PI3K 信号通路的下游靶点SGK1 与ENaC 的关系及在ALI/ARDS中调控AFC的分子基础，是在我们前期研究基础上的深入和完善［2，5］，这对明确疾病的发病机制具有实际价值。

ALI/ARDS近10年病死率居高不下，目前仍然缺乏相对有效的治疗措施。本研究的结果提示激活PI3K/SGK1 信号通路通过上调ENaC 各亚基的表达，增强AFC，减轻肺组织损伤，可作为治疗ALI/ARDS的潜在有效靶点，对疾病治疗提供了参考资料。