非小细胞肺癌中MAGE-D4表达的初步研究

何晓娟 景 红 孔晓煌 孙媛媛

1 河南大学淮河医院病理科，河南省开封市 475003； 2 郑州大学附属郑州市中心医院普胸外科

相关调查研究显示肺癌的发病率和病死率均位居第一，对人类健康危害极大[1]；其中非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌的80%～85%[2]。临床上一部分肺癌患者确诊时已处于局部进展期或晚期，5年生存率<5%，常已失去最佳治疗的机会，放化疗效果差[3]。

近年来免疫治疗不断发展，以抗PD-L1、PD-1为代表的免疫治疗在晚期非小细胞肺癌治疗中取得了令人振奋的效果，较大程度改善了晚期肺癌患者的生活质量，减轻患者痛苦、提高了生存率[4]。因此肺癌免疫治疗靶抗原的研究及寻找意义重大，成为肺癌免疫治疗的焦点。黑色素瘤相关抗原D4(Melanoma-associated antigen D4,MAGE-D4)，既往称为MAGE-E1，是黑色素瘤相关抗原(MAGE)超家族的新成员，由Sasaki等[5]在2001年利用基因表达系列分析发现，是癌—睾丸抗原中一类重要成员。其在NSCLC、食管鳞状细胞癌、脑胶质瘤、乳腺癌、原发性肝癌等恶性肿瘤中存在高表达[6-10]。MAGE-D4能否成为非小细胞肺癌基因和免疫治疗的分子靶点，这些问题需要进一步深入研究。

国内外关于MAGE-D4的文献研究数量少、样本量不足，因此本文通过研究MAGE-D4在非小细胞肺癌中表达情况，及与各项临床、病理特征之间的关系，以期为MAGE-D4在非小细胞肺癌中可能成为新的免疫治疗靶点，提供一些基础理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2017年1月—2020年12月河南大学淮河医院病理科存档NSCLC肿瘤组织蜡块242例及其周边正常对照组织蜡块101例。去除严重破碎及漏切的肿瘤组织5例、周边组织1例，进而所得肿瘤组织共237例，其中腺癌164例(黏液腺癌9例)，鳞癌73例，高分化44例，中—低分化193例，周边共100例。其中男149例，女88例；年龄38～84岁，平均年龄 62.44岁。

1.2 选择标准 纳入标准：可手术切除肿瘤原发灶; 术后病理确诊为非小细胞肺癌；术前未接受过放化疗；周边正常肺组织(距离肿瘤>3cm)；预期生存期超过3个月。排除标准:临床或病理资料不完整; 肺癌复治或合并其他肿瘤；转移性肿瘤；Ⅳ期姑息性治疗病例。

1.3 临床资料收集 收集资料包括性别、年龄、吸烟史、家族史、分期、肿瘤病理类型、肿瘤大小、分化程度、有无淋巴结转移、有无肺被膜侵犯。病理类型及分化程度按2015年WHO 提出的肺癌组织学分类标准分期[11]。临床分期按国际肺癌研究协会(International Association for the study of Lung Cancer,IASLC)2015年制定的第8版肺癌TNM分期[12]。

1.4 方法

1.4.1 试剂。兔抗人MAGE-D4多克隆抗体(invitrogen)按1∶200 稀释后使用，样本稀释液、缓冲液、过氧化物酶阻断剂、二抗及DAB 显色液为购自上海杰浩生物技术有限公司的工作液。

1.4.2 组织芯片制作。使用购自广州市秀威贸易有限公司的组织芯片蜡块，规格2mm，60孔，把挑选好的肿瘤蜡块及周边正常组织蜡块做好标记，按编好的顺序使用广州市秀威贸易有限公司的组织芯片枪在标记部位垂直钻取组织并打入相应的组织芯片蜡块孔。共制作6块组织芯片蜡块，放在45℃烤箱中15min至表面蜡相熔并冷却至室温。

1.4.3 切片制备。制作好的组织芯片蜡块放在冰箱冷冻5min，切成3.5μm厚的石蜡切片，用防脱片捞片，放在65℃烤片机上烤片2h。

1.4.4 免疫组化。石蜡切片常规脱蜡、水化。放在柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中高温抗原修复20min，3%H2O2液封闭内源性过氧化物酶10min。4℃孵育一抗过夜，常温孵育二抗30min。DAB显色，苏木素染核，洗涤、脱水、透明、封片，显微镜下观察并拍照。阳性表达组织做阳性对照，以PBS替代一抗做阴性对照。

1.4.5 结果判定。判断标准：(高倍镜×400)随机选择5个视野，染色范围(即阳性细胞的平均百分比)评分如下：0%计0分；1%～25%计1分；26%～50%计2分；51%～75%计3分；76%～100%计4分。染色程度(即颜色深浅)分级评分如下：0级无色，0分；1级淡黄色，1分；2级棕黄色，2分；3级棕褐色，3分。总积分(h)=染色范围得分×染色程度评分。h<4表示阴性，h≥4表示阳性[13]。

1.5 统计学方法 所得数据采用SPSS26.0软件进行统计分析，计数资料以率(%)表示，比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MAGE-D4在正常肺泡上皮和NSCLC中的表达 MAGE-D4阳性表达多数定位于细胞浆，少部分定位为细胞浆及胞核。癌旁正常肺泡上皮MAGE-D4阳性表达率为49.0%(49/100)，肿瘤组织的MAGE-D4阳性表达率80.2%(190/237)，肿瘤组织的MAGE-D4阳性表达率显著高于癌旁正常肺泡上皮(χ2=33.13，P<0.000 1)。见图1。

图1 免疫组织化学法检测MAGE-D4在肿瘤及周边肺泡组织中的表达(IHC×200)

2.2 NSCLC组织中MAGE-D4表达与患者临床病理因素之间的关系 实验结果显示，MAGE-D4阳性率与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤分期、肿瘤分化程度有关(P<0.05)；而与性别、组织学类型、有无被膜侵犯、有无淋巴结转移、家族史及吸烟史无明显相关性(P>0.05)。见表1。

表1 非小细胞肺癌组织中MAGE-D4表达与临床病理参数间的关系[n(%)]

3 讨论

2001年，有学者发现了黑色素瘤相关抗原家族又一新成员即黑色素瘤相关抗原E1(MAGE-E1)[5]。黑色素瘤相关抗原(MAGE)主要有两类：MAGE-Ⅰ和MAGE-Ⅱ，其中MAGE-E1属于Ⅱ类。由于MAGE-E1染色体结构与MAGE-D非常相似，后将MAGE-E1改名为MAGE-D4。MAGE-D4具有癌—睾丸抗原的特性，即在正常组织不表达，而特异地表达于恶性肿瘤的特性[14]，且能够特异性被T淋巴细胞识别，引起机体以细胞免疫为主的免疫反应，从而特异性识别并杀伤肿瘤细胞[15]，为MAGE成为肿瘤抗原提供理论基础。肿瘤抗原是指在肿瘤发生、发展过程中新出现或过度表达的抗原物质总称，分为肿瘤特异性抗原(Tumor specific antigen,TSA)及肿瘤相关抗原(Tumor associated antigen，TAA)。MAGE属于TAA，具有极高的肿瘤特异性，为肿瘤的免疫治疗带来了希望。

NSCLC的治疗以手术为主，辅助放化疗、靶向、免疫等治疗方式。部分晚期NSCLC 各种治疗方式效果欠佳，5年生存率低[16]。近几年免疫治疗取得了新进展，其中CTLA-4、PD-L1、PD-1为现今研究最广、最为成熟的免疫靶点，取得了较为显著的治疗效果，然而部分患者经抗PD-1、PD-L1治疗后病情进展、治疗无效[17]。临床治疗差异性说明单一的肿瘤生物标志物可能难以满足临床个体治疗的需求。因此联合检测多种肿瘤生物标志物指标是未来的发展趋势。

既往文献发现MAGE-D4在NSCLC、脑胶质瘤、食管鳞癌、乳腺癌，肝癌等多种恶性肿瘤中异常高表达。本实验结果表明，MAGE-D4在NSCLC组织较周边正常肺泡组织表达显著增高，表明非小细胞肺癌组织中的异常高表达(阳性率80.2%)，提示MAGE-D4有可能是非小细胞肺癌的特异性抗原的一种，与文献报道情况相符[6, 18]。然而本实验显示周边3cm以上的正常肺组织中MAGE-D4的表达率为49%,提示MAGE-D4在周边正常肺组织有较高表达，该结果与既往文献报道的MAGE-D4在正常肺组织几乎不表达存在差异[8]。分析差异原因，可能是实验方法的设计不同，在以后研究中应该增加良性疾病肺组织作为对照。然而也有可能是肿瘤周边正常肺组织虽然光镜下无肿瘤性改变，但在MAGE-D4蛋白水平已有变化。笔者后期将进行更多、更详细的实验进一步研究。

本次实验从蛋白水平探索MAGE-D4在肺非小细胞癌中表达，发现MAGE-D4阳性率与患者年龄、肿瘤大小、分期、分化程度呈正相关；而与性别、有无肺被膜侵犯、有无淋巴结转移、有无家族史及有无吸烟无明显相关性，这与Sasaki等相关研究结果相吻合[5]。而Ma等[19]采用实时荧光PCR研究发现：MAGE-D4在分化差的组织及转移的淋巴结中强表达。

综上所述，MAGE-D4与肿瘤的发生发展及预后密切相关，其具体机制目前尚不明确，可能通过化学修饰、信号转导、DNA损伤修复及细胞黏附与识别等方面参与肿瘤的发生和进展。本实验相关数据提示MAGE-D4在肿瘤发生发展中可能承担了重要角色；笔者进一步总结该抗原的相关文献，认为MAGE-D4可能成为肺癌免疫治疗的新靶点，并为晚期肺癌患者免疫治疗增加了新的希望。此外，为肿瘤的免疫治疗提供契机及理论基础，需要后续更多的研究来实现。