马铃薯中烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM的残留检测与储藏稳定性研究

赵子丹，吴 燕，刘 霞，张锋锋，陈 翔，张 艳

（宁夏农产品质量标准与检测技术研究所，宁夏 银川 750002）

马铃薯生长适应性强，兼具食用、加工、饲料等多种功能，目前已成为世界第四大粮食作物[1]，在我国国民经济发展中占有非常重要的地位。随着马铃薯主粮化战略的提出，伴随种植规模化的大力推进，病虫害已成为严重制约马铃薯产业发展的因素之一[2]。晚疫病是马铃薯的主要病害之一，每年可造成我国马铃薯减产约10%～15%[3]。目前，施用高效低毒的化学农药仍是有效防治该病害的主要方式。烯酰吗啉（Dimethomorph）是通过抑制卵菌细胞壁的形成而杀灭病菌的内吸性杀菌剂[4]，对霜霉目真菌类疫病有较好的防治效果[5-8]。氟吡菌胺（Fluopicolide）是一种具有内吸传导活性的新型低毒杀菌剂，通过作用于细胞膜和细胞间的特异性蛋白而杀灭病原菌[9]。氟吡菌胺的残留物定义为氟吡菌胺及其代谢物2,6-二氯苯甲酰胺（BAM）。因此，在检测氟吡菌胺时应同时检测BAM的残留。有研究表明，氟吡菌胺对葡萄[10-11]、马铃薯[12]、番茄[13]、黄瓜[14]、叶用莴苣[15]、节瓜[16]等多种作物的霜霉病、晚疫病等均具有良好的防治效果。

当前，针对马铃薯晚疫病防治的最有效措施是喷施复合杀菌剂[17-18]，既可降低抗性产生的概率，又能提高杀菌效果。关于单独喷施烯酰吗啉或氟吡菌胺防治马铃薯晚疫病的残留检测已有报道[19-20]。但烯酰吗啉和氟吡菌胺的复合杀菌剂在马铃薯中使用后的残留及代谢物检测尚未见报道。本文采用超高效液相色谱串联质谱技术，结合QuEChERS处理方法，建立了马铃薯中烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM的残留量分析方法，该方法的前处理简便、分析快速准确，可为马铃薯中烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM的检测分析提供技术支撑。

通常在农药残留检测的过程中，含有残留的样品会在冷冻条件下储藏一段时间，在此过程中农药残留物可能会因为挥发或与酶等发生反应而有所损失或变化。因此，需要进行农药在该基质中的储藏稳定性研究。故同时进行了烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM在马铃薯中储藏期间的稳定性试验，以期为烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM在马铃薯中的稳定性研究提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

马铃薯样品，采自宁夏农林科学院园林场试验基地，品种为克新1号。

烯酰吗啉标准品（98.78%）、氟吡菌胺标准品（98.78%）、BAM标准品（99.43%），德国Dr.Ehrenstorfer公司；36%氟吡菌胺·烯酰吗啉悬浮剂（农药制剂中有效成分含量为：氟吡菌胺6%，烯酰吗啉30%），江阴苏利化学股份有限公司。乙腈、甲醇（色谱纯），默克股份两合公司；氯化钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基键合硅胶（C18）、石墨化炭黑（GCB），上海安谱实验科技股份有限公司。

1.1.2 仪器与设备

AB SCIEX QTRAP 5500超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪，美国应用生物系统公司；PL202-L型电子天平、XS205型电子天平，瑞士Mettler Toledo仪器有限公司；MJ-PB12Power304破壁料理机，广东美的生活电器制造有限公司；THZ-92C恒温振荡器，上海乔跃电子有限公司；TDL-40C低速台式大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；MS3 digital型涡旋混合器，德国IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制

将烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM标准品分别用乙腈溶解并定容，配制成1 000 mg/L的标准储备溶液，再分别用乙腈稀释配制成10 mg/L的标准储备液，于-18℃冰箱中保存备用。样品分析时，再分别用马铃薯空白基质溶液逐级稀释为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L系列标准溶液。

1.2.2 样品的提取与净化

准确称取匀浆的马铃薯样品10.00 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，振荡提取30 min，加入4 g氯化钠充分振摇1 min后，4 000 r/min离心5 min。吸取上清液2.0 mL，经50 mg PSA和50 mg C18的混合净化剂净化后，涡旋1 min，4 000 r/min离心5 min。上清液经0.22μm滤膜过滤，待测。

1.2.3 液相色谱条件

Waters Acquity BEHC18（2.1 mm×100 mm，1.7μm）色谱柱；柱温40℃；进样量2μL；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸水溶液；流速0.3 mL/min；梯度洗脱程序：0～3 min，流动相A 10%～90%，保持0.6 min；3.6～4.0 min，流动相A 90%～10%，保持2 min。

1.2.4 质谱条件

电喷雾离子源，电离方式：ESI+；离子源温度：500℃；离子化电压：5 500 V；喷雾气流速：50 L/h；气帘气流速：50 L/h；碰撞气流速：约200～600 L/h；定量方式：外标法；扫描模式：多重反应监测（MRM）。

1.2.5 储藏稳定性试验设计

称取马铃薯空白样品10.00 g于50 mL离心管中，按照0.50 mg/kg的添加水平直接在储藏稳定试验所需的空白样品中分别单独添加烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM标准溶液，将所有离心管进行密封，放入低于-18℃冰箱中保存。将样品制备当天、2周、1个月、2个月、4个月、6个月作为取样时间点，每次取稳定性试验样品2个进行测定，同时测定空白样品1个，质控样品3个。其中质控样品为取样当天对空白样本分别进行烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM标准溶液的添加。定期取样，按照建立的检测方法测定。

1.2.6 数据处理

采用MultiQuantTM软件对数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

分别配制1 mg/L的烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM标准溶液，通过针泵进样，在电喷雾电离ESI（+/-）方式下进行全扫描（m/z 50～450）。结果表明，目标化合物均在正离子扫描时出现较强的分子离子峰[M+H]+。因此，本研究选择正离子扫描方式，以[M+H]+为化合物的母离子碎片峰，分别确定母离子后再依次优化子离子。选择信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定性定量离子对，以多重反应监测正离子模式分别优化目标化合物的碰撞能量和去簇电压等质谱参数，最终经过优化后获得的质谱条件见表1。

表1 目标化合物的液相色谱-二级质谱联用法（LC-MS/MS）参数Table 1 LC-MS/MS parameters of target pesticide

采用上述确定的色谱条件和质谱条件对0.1 mg/L标准溶液进样，得到烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM的标准溶液总离子流图，见图1。

图1 烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM的标准溶液总离子流图Fig.1 Standard solution total ion chromatogram of dimethomorph,fluopicolide and its metabolites

2.2 净化剂的选择

通过对PSA、C18和GCB 3种净化剂的使用方式和用量优化马铃薯中目标物净化回收效果。试验结果表明，GCB对烯酰吗啉有吸附作用，因此确定选择PSA和C18为净化剂。通过对PSA和C18的用量进行不同配比优化，得到50 mg PSA和50 mg C18的组合净化效果最佳。

2.3 方法的线性范围和检出限

为了消除基质效应的影响，使用马铃薯空白样品提取液，配制基质标准溶液。将10 mg/L的烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM标准溶液分别稀释配制成浓度为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L系列基质标准溶液，上机测定。根据测定结果，以标准溶液浓度为横坐标（x），响应峰峰面积为纵坐标（y），绘制烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM的标准曲线。由表2可知，烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM在0.01～0.50 mg/L浓度范围内线性良好，相关系数r值均大于0.999。以称样量为10 g，定容体积为20 mL计，通过3倍信噪比计算检出限（LOD），烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM的检出限均为0.002 mg/kg。

表2 烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM的线性方程、r值及检出限Table 2 Linear regression equations,correlation coef cients(r)and LOD of dimethomorph,fluopicolide and its metabolites BAM

2.4 方法的准确度和精密度

在马铃薯空白样品中分别添加浓度为0.01、0.10、0.50 mg/kg的烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM的标准溶液，每个浓度重复5次，按照上述方法对样品进行测定。由表3可知，在0.01～0.50 mg/kg添加水平范围内，烯酰吗啉在马铃薯中平均添加回收率为90%～96%，相对标准偏差（RSD）为3.6%～5.5%；氟吡菌胺在马铃薯中的平均添加回收率为94%～96%，相对标准偏差为1.9%～3.2%；BAM在马铃薯中的平均添加回收率为93%～96%，相对标准偏差为0.6%～2.7%。上述结果表明，方法的准确度和精密度均能够满足农药残留试验准则的要求（NY/T 788—2018[21]），且目标峰无杂质干扰。

表3 烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM在马铃薯中的添加回收率和相对标准偏差（n=5）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of dimethomorph,fluopicolide and its metabolites BAM in potato(n=5)

2.5 储藏稳定性试验

由表4可知，在低于-18℃条件下储藏6个月的试验期间，马铃薯基质中烯酰吗啉的平均降解率为7%～19%，质控结果为92%～97%；氟吡菌胺的降解率为0～16%，质控结果为92%～100%；BAM的降解率为0～13%，质控结果为93%～101%，其中质控样品检测结果以平均回收率表示，结果符合农药残留试验准则的要求。根据NY/T 3094—2017[22]的规定，每个取样时间点的储藏试验样品中烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM的降解率均小于30%，表明在储藏温度低于-18℃、储藏时间为6个月的试验期间，烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM在马铃薯基质中均比较稳定。

表4 烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM在马铃薯中的储藏稳定性结果Table 4 Storage stability results of dimethomorph,fluopicolide and its metabolites in potatoes 单位：%

3 结论

本试验以乙腈为提取试剂，建立了马铃薯中烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM检测的超高效液相色谱串联质谱分析方法。方法采用QuEChERS前处理，乙腈用量少，分析时间短，节约了试验成本，提高了试验效率，可为其他农产品及食品中烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM的残留检测提供参考依据。烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM在0.01～0.50 mg/kg浓度范围内的平均添加回收率为90%～96%，表明方法的准确度高，精密度好，符合农药残留检测分析要求。储藏稳定性试验结果表明，储藏温度低于-18℃、储藏时间为6个月的试验期间，烯酰吗啉、氟吡菌胺及其代谢物BAM在马铃薯中均比较稳定。