辽宁省玉米品种种质SSR分子多样性分析

朱志成

(辽宁省农业发展服务中心省种业发展中心,辽宁 沈阳 110034)

玉米是辽宁省第1大作物，优质玉米品种是实现玉米产业优质高效的重要基础，也是产前技术的核心，种质基础是选育玉米新品种的根基，正确分析与评价辽宁省品种种质基础，为创新和突破现有的育种水平提供依据[1]。本文研究玉米品种SSR分子聚类分析，以期使分子标记辅助育种得到实际应用。因此，利用SSR分子技术对玉米品种种质进行聚类分析，对杂种优势群的划分、种质创新及新品种的选育等具有指导意义[2]。

玉米品种的分子鉴定技术经过十多年的系统研究和鉴定实践，从RAPD标记技术，到目前基于SSR标记技术日趋成熟。SSR标记技术相比RFLP、RAPD和AFLP等标记，具有多态性高、共显性遗传和操作简单等优点[3]，应用在禾谷类、豆类、薯类和蔬菜类等作物的遗传图谱构建、品种鉴定、基因定位和分子辅助育种等领域。国内外学者以玉米品种为实验材料，通过20～70个SSR引物进行扩增，检测到上百个等位基因变异位点，表明具有丰富的多态性信息，可以进行种质资源鉴定、杂种优势群划分、QTL定位和分子辅助育种等研究[4]。

本研究利用SSR分子技术对目前辽宁省主要推广的20个玉米品种进行分子鉴定，为更好地利用辽宁省优质玉米品种种质，以及分子标记辅助育种提供遗传信息奠定基础。

1 材料

供试材料为20种不同玉米品种，由辽宁省种子管理局提供。品种名称见表1。

表1 供试玉米品种名称

2 方法

2.1 玉米品种基因组DNA提取

采用CTAB法提取玉米种子DNA[5]。

2.2 玉米品种SSR引物合成

根据国内外有关文献，考虑引物多态性，并评价其在均匀地分布在染色体上，筛选20对SSR核心引物[5]，见表2，由大连TaKaRa生物工程公司合成。

2.3 玉米品种PCR扩增

PCR反应终浓度组成为1×PCR Buffer，Mg2+2.5mmol·L-1，dNTPs 0.15mmol·L-1，双向向引物0.25μmol·L-1，Taq DNA聚合酶1.0U，DNA模板2μL，总体积达到20μL。

反应程序：94℃时预变性5min，94℃时变性40s，60℃时退火35s，72℃时延伸45s，循环扩增35次，72℃时延伸5min，4℃时保存待测。

表2 20对SSR核心引物

2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离电泳

PCR扩增产物在94℃变性5min后，用4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。预电泳恒功率为90W，时间为20min；电泳分离恒功率为80W，时间为40min。用10%冰醋酸，固定时间为5min，用0.2%AgNO3溶液，染色时间为5min；双蒸水漂洗凝胶2次，每次时间10s；用1.5% NaOH、0.4%甲醛配制显影液，显影；10%冰醋酸对凝胶定影。

2.5 数据处理

将不同玉米品种在同一引物扩增的所有DNA谱带统一排序，按照扩增片段从小到大顺序，在相同迁移位置有谱带的记录“1”，没有谱带的记录“0”，缺失记录“9”，聚类分析0-1数据系统，距离系数为Nei,Lix系数，Cs=1-2a/(2a+b+c)按UPGMA方法进行聚类。所有的数据处理均采用Microsoft Excel 2013和Microsoft Word 2013，对玉米品种SSR分子鉴定结果进行聚类分析采用DPS 7.05。

3 结果

3.1 玉米品种的SSR分子鉴定结果

如图1所示，PCR产物在电泳分离显影后，DNA扩增条带清晰可辨，具有良多态性，可以将结果记录统计。将引物扩增的所有DNA谱带统一排序，按照扩增片段从小到大顺序，有谱带的记录“1”，没有谱带的记录“0”，缺失记录“9”,形成统计表用于聚类分析。

SSR分子技术分析中选取20对引物，在供试材料中共检测到118谱带，即118等位基因变异，选取清晰可辨的多态性片段83条用于数据统计。

3.2 玉米品种SSR聚类分析结果

图1 不同SSR引物扩增玉米的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱

本研究20对SSR核心引物中，电泳谱带清晰且稳定，平均分布在每一条染色体上，满足玉米品种SSR分析。共检测出83个等位基因。从图2可知，各品种间遗传距离系数为0.13～0.79，选取0.57为阈值，20个品种依据阀值可以划分为4个类群，其中品种“乾坤1101”、“金刚98”、“郑单958”、“连科8号”、“辽禾308”、“丹玉336号”、“乾坤528”等7个供试样品划为第Ⅰ类群；品种“东单60”划为第Ⅱ类群；品种“锦成九”、“铁南2号”、“铁研818”、“郁青1号”、“辽单452”、“致泰6号”、“千松101号”、“佳昌689”、“铁旭1843”、“郁青123号”等10个供试样品划为第Ⅲ类群；品种“元钰66”、“富友1号”等2个供试样品划为第Ⅳ类群。

图2 玉米品种SSR鉴定聚类树状图

通过杂种优势模式的分析，可知旅黄改系统的品种全部划分在第Ⅰ类群中，群内品种之间的遗传距离为0.14～0.66；“东单60”单独成1个群，为旅大红骨系统，同第Ⅰ类群亲缘关系较近；第Ⅲ类群的群内品种绝大部分是瑞德系统改良的品种，品种之间的遗传距离为0.18～0.64；品种“元钰66”、“富友1号”等2个供试样品独立成群，与其它品种亲缘关系较远。结果表明，辽宁主栽玉米品种中，旅黄改系统的应用有明显增加的幅度，同时，瑞德系统改良的品种也有上升趋势，说明辽宁玉米品种种质具有一定的遗传多样性。

4 讨论

辽宁省位于东北平原，其地貌类型复杂多样。东南部以山地丘陵沿海为主，中北部以平原内陆为主，由于地势和环境等因素，当地延续下来品种经过长期的实践选择，具有一定的品种种质多样性。同时，本研究选取的品种数量有一定的局限性，若增加供试品种数量，聚类分析划分的类群会更细致些。

本文选取20对SSR引物进行研究，对其结果聚类分析，通过品种间的血缘关系远近，划分不同的类群。对试验进一步增加所选SSR引物，也可增加类群数量，但划分类群过细，也不利用类群内挑选适当遗传距离的目标株系。通过下一步与配合力测定及评价相结合，拓宽辽宁省的玉米遗传基础提供物质基础和理论参考，为更好地利用辽宁省优质玉米品种种质，以及分子标记辅助育种提供遗传信息奠定基础。