银杏叶中蛋白质的提取工艺研究

2022-02-16杨兴变，张蜀美，李俊，王黔阳，何珺

山地农业生物学报 2022年1期

杨兴变，张蜀美，李俊，王黔阳，何珺

摘要：为建立经济、简便、有效的银杏叶蛋白质提取方法，采用正交法对银杏叶中蛋白质进行提取，紫外分光光度法对其进行含量测定。结果表明：银杏叶蛋白质在λ=560 nm波长条件，在050～500 mg/mL的范围内线性关系良好，其标准曲线为y=00645x+00037，R2=0998;银杏叶中蛋白质提取工艺为：料液比为1∶8、提取时间为2 h、提取温度为70 ℃。本方法经济、简便，重复性好，可快速有效地从银杏叶中提取蛋白质，为充分利用银杏叶资源提供实践依据。

关键词：银杏叶;蛋白质;提取

中图分类号：R93文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2022）01-0089-004国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.01.013

Study on the Protein Extraction Technology of Ginkgo Biloba Leaves

Yang Xingbian1，Zhang Zhumei1，2，Li Jun1，2 ，Wang Qianyang3，He Jun1*

（ 1.Research Center of Biochemistry Engineering of Guizhou Province，Guiyang，Guizhou 550025，China;2.College of Pharmacy，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;3.Guizhou Beiyinte Biotechnology Co.，Ltd，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：To establish an economic，simple and effective method for protein extraction from Ginkgo biloba leaves.The orthogonal method was used to extract the protein from the leaves of Ginkgo biloba，and the content of protein of Ginkgo biloba leaves was determined by ultraviolet spectrophotometer （λ=560 nm）.The results showed that the standard curve was y= 0.0645x+0.0037，R2=0.998 and Ginkgo biloba protein had a good relationship in the range of 0.50～5.00 mg/mL.The optimum extraction parameters were as follows：the ratio of material to liquid was 1∶8，the extraction time was 2 h and the extraction temperature was 70 ℃.This method was economical，simple and reproducible，and it can be used to extract protein from Ginkgo biloba leaves quickly and effectively，which provides practical basis for rational and full utilization of Ginkgo biloba leaves resources.

Keywords：Ginkgo biloba leaves;protein;extraction

中國是银杏主产国，约占全球的80 %，银杏叶为银杏科植物银杏（Ginkgo biloba L.）的干燥叶，具有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛的功效[1]，主要含有黄酮类、萜内酯类、有机酸类、酚类、多糖、蛋白质等多种活性成分，其中黄酮类、萜内酯类为银杏叶提取物的主要活性成分，是银杏叶开发利用的重点[2-5]，而对其蛋白质相关研究较少[6]，从银杏叶中提取蛋白质更是未见报道，只见以杂质形式被祛除的报道[7]。蛋白质是生命体重要的组成部分，是食物中的重要组成部分，同时也是药物研究的重要靶点，但目前蛋白质资源短缺尤为严峻[8-11]，因此，解决蛋白质资源短缺已经成为全球关注的热点问题。据查阅文献，银杏干叶中蛋白质含量598 %，可以作为一种蛋白质来源加以利用[6，11]。银杏叶蛋白质中含有亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和色氨酸等人体必需的6种氨基酸。然而，在生产银杏叶提取物时，大量的水溶液、水洗液被直接丢弃，而银杏叶中的蛋白质就在被直接丢弃的水溶液、水洗液中，造成了资源的浪费。因此，本文利用正交法建立银杏叶中蛋白质的提取方法，使银杏叶在生产银杏叶提取物的同时，可对其蛋白质进行提取回收利用。这不仅可以提高银杏叶资源的综合利用率，还可以减少生产废液的排放，为银杏产业的发展提供参考。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

电子天平（BSA124S，赛多利斯科学仪器公司）;紫外可见分光光度计（Cary 60 UV-Vis，Agilent Technologies）;电热鼓风干燥箱（GZX-9140 MBE，上海博讯实业有限公司医疗厂）;电热恒温水锅浴（HHW21-600C，常州华奥仪器制造有限公司）;粉碎机（FSJ-A05N6，龙港市创达商贸有限公司）等。

氢氧化钠、酒石酸钾钠、无水硫酸铜，均为分析纯;水为娃哈哈纯净水。

1.2试验材料及对照品

材料：银杏叶（8年生干银杏叶，2020年7月20号购于道真华山绿色产业公司）;

对照品：酪蛋白（含量>96%，批号：202009 02，山东萍聚生物科技有限公司）;

双缩脲试剂：精密称取3015 g的氢氧化钠溶于300 mL的水中得到A液，精密称取酒石酸钾钠599 g和无水硫酸铜150 g溶于500 mL的水中得到B液，将A、B液混合摇匀即得。

酪蛋白标准品溶液的制备：精密称取05002 g酪蛋白于100 mL容量瓶中，加入005 mol/mL的氢氧化钠溶液，定容，摇匀，即得500 mg/mL的酪蛋白标准品溶液。

1.3试验方法

1.3.1蛋白质标准曲线绘制

取7支具塞试管，按表1系列梯度精密移取酪蛋白标准溶液和纯水。

快速在每支试管中加入6 mL的双缩脲试剂，振荡均匀，加完后置于室温下反应30 min，然后在560 nm波长下，以纯水为空白，迅速测其吸光度并绘制标准曲线。

银杏叶蛋白质含量测定：分别将对应的对照品溶液与供试品溶液放入紫外分光光度仪，记录各自吸光度值，根据线性关系计算相应的浓度，其质量及含量按公式（1）、（2）计算：

蛋白质的质量（mg）=测定蛋白质浓度（mg/mL）×样液体积（mL）（1）

蛋白质的含量=蛋白质质量（mg）/样品的质量（mg）×100%（2）

1.3.2银杏叶中蛋白质提取单因素考察

将银杏叶放在60 ℃的电热鼓风干燥箱中烘至完全干燥，粉碎，过 80目筛，得到银杏叶粉末供试品。

提取温度考察：精密称取 1 g 的银杏叶供试品粉末于 10 mL具塞试管中，共称取5份。按1∶10的料液比加入蒸馏水，分别在设定的温度20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃条件下，水浴提取1 h，趁热抽滤即得不同温度提取的供试品溶液;按照银杏叶蛋白质含量测定方法测其吸光度值。

料液比考察：精密称取 1 g 的银杏叶供试品粉末于 10 mL具塞试管中，共称取5份。分别按不同的1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14等料液比加入蒸馏水，在80 ℃条件下，水浴提取1 h，趁热抽滤即得不同料液比提取的供试品溶液;按照银杏叶蛋白质含量测定方法测其吸光度值。

提取时间考察：精密称取 1 g 的银杏叶供试品粉末于 10 mL具塞试管中，共称取5份。按1∶10的料液比加入蒸馏水，在80 ℃条件下，分别水浴提取1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，趁热抽滤即得不同时间提取的供试品溶液;按照银杏叶蛋白质含量测定方法测其吸光度值。

1.3.3银杏叶蛋白质提取正交试验

根据单因素结果，结合文献[12-15]和实际大生产的经验，以水为溶剂，料液比、提取时间、温度为主要因素，各个因素设置三个水平，进行正交试验分析，因素和水平值见表2。

精密称取银杏叶粉末1.00 g置于试管中，根据正交试验因素水平表中料液比的要求，加入相对应的纯水并将其密封好，平行操作下水浴加热提取，滤过，获得提取液，将其稀释不同倍数并加入双缩脲溶液60 mL，在室温下反应30 min，在560 nm测其吸光度，根据公式（1）、（2）和线性关系计算含量。

1.3.4重復性验证试验

平行称取三批次银杏叶粉末，按正交试验最佳方法提取银杏叶中的蛋白质，滤过，得到提取液，取样测其含量。

2结果与分析

2.1线性关系的结果

以对照品浓度为X轴（横坐标），以吸光度值为Y轴（纵坐标）绘制标准曲线，结果见图1。

由图1得到酪蛋白在λ=560 nm波长条件，其标准曲线为y=00645x+00037（R2=0998），表明酪蛋白在050～500 mg/mL的范围内线性关系良好，可用于后续银杏叶中提取蛋白质的检测。

2.2单因素考察结果

以计算得到银杏叶中蛋白质的百分含量与对应的提取温度、料液比、提取时间作图，结果分别见图2、图3和图4。

由图2可知，随着温度的上升，银杏叶中蛋白质提取百分含量逐渐上升，80 ℃达到最高，温度继续上升反而降低，这有可能温度过高，导致蛋白质不可逆变性沉淀，检测时保证溶液的清亮而被过滤损失，故选择 60 ℃、70 ℃、80 ℃ 三个水平进行正交试验。

由图3可知，料液比为1∶8时，银杏叶中蛋白质基本被完全提取出来，随着料液比增加，银杏叶中蛋白质的提取百分含量已经平稳，故选择料液比1∶6、1∶8、1∶10 三个水平进行正交试验。

由图4可知，随着提取时间的增加，银杏叶中蛋白质提取百分含量逐渐上升，提取越充分，但到达2 h后，银杏叶中蛋白质的提取百分含量增加较缓慢，故选择提取时间1 h、2 h、3 h 三个水平进行正交试验。

2.3正交试验数据与结果

由极差分析结果（表3）可以看出，C因素影响效果比较显著;考察因素强度为C>B>A，A因素中A2>A3>A1，B因素中B2>B1>B3，C因素中C2>C3>C1，最佳工艺条件为A2B2C2，即是料液比为1∶8，提取时间为2 h，提取温度为70 ℃ 。

2.3验证试验数据与结果

从验证试验结果（表4）可以看出，三批次提取液中含量相差不大，说明工艺稳定，可以有效的提取银杏叶中的蛋白质。

3结论与讨论

蛋白质是一切生命活动的基础，也是构成生物细胞的重要成分，是动物或者人类都不可缺少的物品。然而目前遇到非常严峻的问题，在全球约有1/5的人口严重缺乏蛋白质的补充，蛋白质资源短缺已经成为全球关注的问题，特别是发展中国家[10]。除此之外，蛋白质也是药物研究的重要靶点。因此，解决蛋白质资源短缺已经成为全球关注的热点问题。

中国是世界上银杏分布最广的区域，约占全球的85 %，银杏叶富含多种活性物质，例如黄酮、内酯、多糖和烷基酚酸等。目前，银杏的研究一直以来都吸引无数国内外科研工作者的眼球，尤其是以黄酮、萜内酯为主要有效成分的银杏叶提取物的研究最受瞩目，是银杏叶开发利用的重点[2-5]。据文献[6，11]报道，银杏叶中蛋白质含量相对来说不少，可作为蛋白质来源的一种。本文采用正交法，以水为溶剂，料液比、提取时间、温度为主要因素对银杏叶中蛋白质提取，紫外分光光度法对其进行含量测定。通过正交试验得到银杏叶中蛋白质提取工艺为：料液比为1∶8、提取时间为2 h、提取温度为70 ℃。验证试验得到三批次提取液中蛋白质含量为3.72 %，RSD%为0.12，说明该工艺稳定，可以有效的提取银杏叶中的蛋白质，该方法经济、简便，重复性好，可快速有效地从银杏叶中提取蛋白质，使银杏叶在生产银杏叶提取物的同时，可对其蛋白质进行提取回收利用。这不仅可以提高银杏叶资源的综合利用率，还可以减少生产废液的排放，为充分利用银杏叶资源提供实践依据。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2020：329-330.

[2]夏晓晖，张宇，郗砚彬，等.银杏叶化学成分研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2009，15（9）：100-104.

[3]Van Beek T A.Chemical analysis of Ginkgo biolba leaves and extracts[J].Journal of Chromatography A，2002，967（1）：21-55.

[4]Sing B，Kaur P，Gopichan D，et al.Biology and chemistry of Ginkgo biloba[J].Fitoterapia，2008，79：401-418.

[5]楊兴变，郁建平，李洪庆.注射剂用银杏叶提取物生产工艺监控研究[J].贵州大学学报（自然科学版），2013，30（3）：62-64，86.

[6]梁红，徐斌，潘伟民，等.银杏种子和叶的蛋白质分析[J].植物资源与环境学报，2000，9（4）：5-8.

[7]王筱瑜，季子非，萨日娜，等.银杏落叶粗多糖除蛋白方法的筛选及优化[J].食品工业科技，2019，40（10）：232-237.

[8]梁玉.检验食品中蛋白质含量标准测定方法的改进[J].现代食品，2020（7）：210-212.

[9]刘高强，周虎.复合胰蛋白酶提取松毛虫蛹中总蛋白质的工艺[J].食品科技，2008，33（12）：140-143.

[10]刘高强，周虎，魏美才，等.马尾松毛虫蛹中蛋白质的提取及其营养价值评价[J].食品与发酵工业，2010，36（5）：113-116.

[11]蒋滢.氨基酸的应用[M].北京：世界图书出版公司，1996：168-215.