姜黄素光动力杀灭即食鸡肉中沙门氏菌的研究

曾巧辉，余杏同，区灿盛，王思婷，朱子龙，王敬敬

（1.佛山科学技术学院 食品科学与工程学院，广东 佛山 528225；2.华南食品安全研究发展中心，广东 佛山 528225）

沙门氏菌是一种革兰氏阴性肠道杆菌，是肠杆菌科中一种常见且危害严重的食源性病菌。当前，引起人类疾病的沙门氏菌主要有鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、甲乙丙副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等，当中最为常见是猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌。近年来，由沙门氏菌引起的食物中毒事件仍然占据首位。根据世界卫生组织（WHO，World Health Organization）的报道，2020 年世卫组织成员国共发生127 起食品安全事件，有67 起涉及生物危害事件，其中与沙门氏菌感染相关的有28起，约占生物危害事件的42 %。一般情况下，沙门氏菌易在家禽、家畜、鼠类、人类的肠道中或者粪便中存在，同时，沙门氏菌也较易污染肉制品（鸡肉、猪肉、鱼肉）、蛋制品（鸡蛋）和熏肉制品等食品。近年来，鸡肉消费需求量日益增长。根据联合国粮食及农业组织统计，2019 年中国内陆地区的鸡肉产量已达1,514 万t，约占中国家禽产量的35.7 %。根据国家食品安全风险评估中心对市售鸡肉中沙门氏菌污染水平的调查结果显示，我国大约有40 %的零售鸡肉污染沙门氏菌，并且在较高的温度环境下沙门氏菌污染率更高［1］。此外，我国多个省份已经有过许多沙门氏菌引起的食源性感染实例的报道［2-3］。

目前食品工业中用于杀灭微生物的方法主要包括热处理、紫外线、高密度二氧化碳杀菌、脉冲电场（PEF）、电离辐射和冷冻离子（CP）等。但是高温会影响食品终端产品的营养价值、质地和风味，或产生影响食品安全的不良副产物；脉冲电场（PEF）灭活微生物的效率有限，可能会导致食品蛋白质组分的结构变化；电离辐射技术需要前期高成本的投入，人力资源成本也相对较高；冷冻离子（CP）处理食品可能诱导有毒化合物的形成。因此，需要安全、高效、经济的非热杀菌技术保障食品微生物安全，从而延长食品的货架期［4］，符合现代食品工业发展需求。

光动力技术（PDT）是一种新兴的非热加工技术，其原理是在有氧环境下通过可见光源照射光敏剂（PS）后，产生活性氧自由基（ROS），然后攻击细菌的细胞结构、蛋白质、核酸等生物大分子，从而灭活细菌［5］。与其他传统方法相比，光动力技术具有安全、高效、低能耗、不会诱导细菌产生耐受性等优点。在此基础上，HEBBAR 等［6］利用光动力成功灭活了果汁中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，初步证明光动力技术是一种潜在的微生物灭活方法；GONG 和LI 等［7］研究表明姜黄素光动力可以有效灭活鲟鱼中的特定腐败菌（假单胞菌）；PENHA 等［8］研究表明姜黄素与蓝色LED 联合使用是光动力对抗革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的有效策略。

本研究选择使用天然姜黄素为光敏剂，开展光动力杀灭即食鸡肉中沙门氏菌的研究，主要考虑到以下原因：一是姜黄素是国际食品法典委员会批准的食品添加剂［9］，是符合我国现行国家食品安全标准并且在食品加工中被广泛使用的天然色素之一［10］；二是姜黄素是一种橙黄色的粉末，对于即食鸡肉的感官影响甚微。因此本研究以即食鸡肉为研究载体，选用姜黄素作为光敏剂结合蓝色LED 构建光动力技术，研究光动力技术对即食鸡肉中沙门氏菌的作用功效，在此基础上，将光动力处理后的即食鸡肉分别置于不同的温度（4、16、25℃）下贮藏，分析沙门氏菌的抑制恢复生长情况。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株与样品

鼠伤寒沙门氏菌（编号CM1.237）和肠炎沙门氏菌（编号CM1.345），购买于广东省微生物菌种保藏中心；冷冻鸡胸肉，购买于广东省佛山市狮山镇慧购加满家佛科大店；食品级姜黄（纯度95%），购买于优宝嘉食品旗舰店。

1.1.2 试验试剂与材料

胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB），北京路桥技术股份有限公司；亚硫酸铋琼脂（BS），北京路桥技术股份有限公司；无菌均质袋，常德比克曼生物科技有限公司；一次性塑料培养皿，常德比克曼生物科技有限公司。

1.1.3 仪器与设备

生物安全柜（HR1200-IIA2 型），青岛海尔生物医疗股份有限公司；恒温振荡培养箱（ZHTY-70S型），上海龙跃仪器设备有限公司；酶标仪（FPOCH2 型），美国伯腾仪器有限公司北京代表处；拍打式均质器（ZGJZQ-10 型），上海梓桂仪器有限公司；手提式压力蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-18SI 型），上海博迅实业有限公司医疗设备厂；恒温恒湿培养箱（LRHS-300F-Ⅱ型），上海龙跃仪器设备有限公司；LED 灯阵列（波长为430 nm）。

1.2 试验设计

1.2.1 菌种的培养

分别取贮藏于-80 ℃条件下的鼠伤寒沙门氏菌（CM1.237）和肠炎沙门氏菌（CM1.345）放置于4 ℃下冻融。然后，取0.1 mL 混合菌液于10 mL 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中，37 °C 下震荡（160 rpm）培养8～10 h，调节菌悬液吸光值介于0.7～0.8 之间，平板涂布法测定菌落数介于8～9 log CFU/mL。

1.2.2 鸡肉样品的制备

取鸡胸肉在常温下解冻，然后切成质量为10±0.1 g的鸡肉块，将鸡肉块蒸煮8 min 杀死自身可能携带的本底微生物。处理结束后，使用漏勺捞起鸡肉后迅速置于生物安全柜中静置冷却至常温，备用。

1.2.3 鸡肉样品的接种

将姜黄素母液（0.368 4 g 姜黄素溶解在10 g 乙醇中）和原菌液用0.9 %（w/v）的生理盐水稀释成菌悬液，取100 μL 菌悬液接种于10±0.1 g 鸡肉块中，放置在37 ℃暗处条件下孵育20 min（100 rpm），然后置于常温下干燥5 min 以便细菌更好地附着于鸡肉块上，最终鸡肉上的沙门氏菌为3～4 log CFU/g。

1.2.4 光动力处理

本实验使用的光源为波长430 nm的LED 阵列。将接种沙门氏菌的即食鸡肉放置在6 孔板中，然后置于LED 阵列的下方，用照度计测得光强度为4 000 lux。利用光度转换公式计算辐照度P［11］

式中，P 为辐照度/功率密度（W/m2），L 为光强度（lux），Km=683 lm/W（光谱光视效能的最大值），V（λ）=0.032（在430 nm 处的光敏光谱函数）。

鸡肉中LED 辐照能量使用下列公式计算［6］

式中，E 为辐照能量（J/cm2），P 为辐照度/功率密度（W/m2），t 为光动力处理时间（s）。

光敏剂浓度的选择：制备浓度分别为0、100、200、300 μmol/L的姜黄素接种在鸡肉上，然后在室温下置于LED 阵列下60 min（66 J/cm2）。

辐照能量的选择：将姜黄素接种于鸡肉中制备终浓度为200 μmol/L的实验样品，在室温下分别置于LED 阵列下处理0、33、66、99 J/cm2（0、30、60、90 min）。

1.2.5 鸡肉样品的培养

将切好的鸡肉样品分成两组，分别为对照组（L-C-）（未进行光动力处理：未加姜黄素和未进行照射处理）和光动力处理组（L+C+），放置在4、16、25 ℃下恒温培养箱中培养不同时间，并定时测定菌数。其中4 °C 分别在0、8、16、24、48、72 h 时取样测定；16 °C 在0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 h 时取样测定；25 °C 在0、2.5、5、10、15、20、25、30、35、40 h 时取样测定。

1.2.6 鸡肉样品的涂板计数

取鸡肉样品（10±0.1 g）置于90 mL0.9%（w/v）生理盐水中，利用拍打式均质器拍打1 min，均质速度为5 次/s。取1 mL 均质液，用0.9%（w/v）生理盐水稀释至合适的浓度，然后取100 μL 菌液在亚硫酸铋琼脂（BS）平板上涂布，37°C 下培养40～48 h 后计数［12］。

他从不知道世间竟会有如此大片的凶险地界，即便他自觉技术高超，也没有把握自己能够在这里安全地降落，一半的把握都没有。

1.2.7 统计分析

所有实验均进行3 次独立重复实验，实验数据均以平均数±标准差表示。采用SPSS 26 软件进行显著性差异分析，显著性差异水平选取P＜0.05；采用Origin 2018 软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 光敏剂浓度对鸡肉中沙门氏菌杀灭效果的影响

图1 展示了在66 J/cm2能量照射下不同浓度的姜黄素对即食鸡肉中沙门氏菌的光动力作用效果。由图1 可知，姜黄素光动力处理的即食鸡肉中沙门氏菌的菌落总数总体低于空白对照组中细菌总数。深入分析发现，空白对照组中的沙门氏菌总数约为3.85 log CFU/g，然后，添加姜黄素至200 μmol/L 时，光动力处理后即食鸡肉中的沙门氏菌的总数显著（P＜0.05）下降至3.40 log CFU/g，降低了约0.4 log CFU/g。因此，200 μmol/L 姜黄素介导光动力能够显著抑制即食鸡肉中沙门氏菌的生长，因此，姜黄素最佳浓度选择200 μmol/L。

图1 姜黄素浓度对即食鸡肉中沙门氏菌的作用效果

2.2 辐照能量对鸡肉中沙门氏菌杀灭效果的影响

图2 展示了200 μmol/L 姜黄素光动力在不同辐照能量（0、33、66、99 J/cm2）作用下即食鸡肉中沙门氏菌的杀灭效果。由图2 可知，光动力处理后的即食鸡肉中沙门氏菌总数均有所减少，尤其在辐照能量为33 J/cm2时，即食鸡肉中沙门氏菌的总数减少得最多，并且具有统计学上的显著差异（P＜0.05）。当辐照能量为0 时，即食鸡肉中沙门氏菌的菌落总数为4.36 log CFU/g，当辐照能量为33 J/cm2时，即食鸡肉中沙门氏菌下降至3.43 log CFU/g，降低了约0.9 log CFU/g。所以，33 J/cm2辐照能量能够显著抑制即食鸡肉中沙门氏菌的生长，因此，光动力处理的最佳辐照能量选择33 J/cm2。

图2 辐照能量对即食鸡肉中沙门氏菌的作用效果

综上可得，姜黄素光动力最佳姜黄素浓度为200 μmol/L，最佳辐照能量为33 J/cm2。

2.3 不同贮藏温度下即食鸡肉中沙门氏菌的生长情况

图3 分别展示了光动力处理组（L+C+）和空白对照组（L-C-）即食鸡肉中沙门氏菌在4 ℃、16 ℃、25 ℃条件下贮藏的生长情况。

图3 不同温度下光动力处理组（L+C+）和对照组（L-C-）鸡肉中沙门氏菌的生长

由图可知，在4 ℃条件下贮藏的空白对照组中沙门氏菌总数由4.27 log CFU/g 下降到3.63 log CFU/g；同样地，光动力处理组（L+C+）中沙门氏菌的菌落总数由4.21 log CFU/g 下降到3.36 log CFU/g。然而，在16、25 ℃贮藏条件下，光动力处理组和空白对照组中沙门氏菌均呈现S 型曲线生长，均由初始接种量～4 log CFU/g 生长到～8 log CFU/g，但是与空白对照组（L-C-）相比，光动力处理组（L+C+）中细菌达到生长稳定期的时间较长，说明光动力处理显著降低了鸡肉中细菌的生长速率；此外，与16 ℃条件下贮藏的鸡肉相比，25 ℃条件下即食鸡肉中沙门氏菌的生长速率更快。

3 讨论

3.1 光动力杀菌效果研究

CHEN［13］等研究表明，光动力技术主要是通过诱导蛋白质降解和细胞结构破裂灭活细菌。在本研究中，LED 阵列（430 nm）光源波长与姜黄素的吸收光谱（400～500 nm）范围重叠；其次，沙门氏菌的细胞壁由一层相对疏水（脂多糖层）的外膜构成，能有效地吸附脂溶性姜黄素。基于此，在LED 阵列照射下，细胞膜上吸附的姜黄素产生的活性氧自由基（ROS）攻击细菌膜上的脂质和蛋白质，加速了沙门氏菌的失活。因此，光动力技术可以杀灭即食鸡肉中沙门氏菌。

王小情等［14］研究发现，当光敏剂浓度过高时大量光敏剂不能够进行有效吸附，在此条件下未吸附的光敏剂吸收光照能量，使菌体表面的有效光照能量减少。在本研究中，当姜黄素浓度超过一定的阈值（＞200 μmol/L）时，鸡肉中部分姜黄素未与细菌表面充分结合，吸收光照能量弱化了光动力杀菌效果。因此，高浓度的姜黄素反而削弱了光动力技术对沙门氏菌的作用效果。

在200 μmol/L 姜黄素浓度、33 J/cm2辐照能量作用下，即食鸡肉中沙门氏菌减少了约0.9 log CFU/g。与现有的研究结果相比，本研究构建的光动力作用功效较弱，这可能主要与细菌的革兰氏属性密切相关。大量研究表明光动力对革兰氏阴性菌的杀灭效果弱于其对革兰氏阳性菌的作用效果［15］，这主要是因为姜黄素光动力杀灭革兰氏阴性菌的主要靶点是细菌的外部结构。具体来说，革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，但其细胞壁上有相对多孔结构，光敏剂易于穿透进入细胞质中，因此，其对外源光敏剂介导的光动力反应比较敏感；革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，但结构较复杂，由内壁层（肽聚糖层）和外壁层（脂蛋白、磷脂层、脂多糖）两部分构成，形成细胞和外界环境的屏障，一定程度上能够阻止外源光敏剂的进入［16］。

3.2 不同温度对即食鸡肉中沙门氏菌的影响

随着人们饮食习惯的改变及食品加工产业的创新发展，各种即食鸡肉制品应运而生，其中包括即食鸡胸肉、鸡爪、鸡腿、白切鸡等等。这些即食鸡肉制品在加工、运输、储存、消费过程中均容易被沙门氏菌污染，并且受不同贮藏温度的影响，极易诱发食源性疾病。综合以上因素，本实验选取日常生活中常见的典型温度（4、16、25 ℃）为实验条件，探究光动力处理后即食鸡肉中沙门氏菌的生长情况。

在16 ℃和25 ℃条件下，即食鸡肉中沙门氏菌呈现S 形曲线生长，且到达稳定期的沙门氏菌总数均介于8～9 log CFU/g 之间。与16 ℃相比，25 ℃下沙门氏菌的生长速率更高，迟滞期也更短，但达到稳定期的菌落总数大体一致，因此，在足够的贮藏时间条件下温度对鸡肉中沙门氏菌的生长规律并无显著性影响。此外，研究发现16 ℃条件下鸡肉中沙门氏菌生长达到稳定期的时间为70 h，然而，在25 ℃条件下沙门氏菌的生长速率明显增快，仅20 h 就可以达到生长稳定期。由此可见，沙门氏菌的生长速率受温度的影响较大，温度越高，沙门氏菌的生长速率越快。与空白对照组相比，光动力处理组延缓了沙门氏菌到达稳定期的时间，因此，在适宜温度下，光动力处理能够显著降低沙门氏菌的生长速率。

在4 ℃条件下，所有鸡肉中沙门氏菌的数量没有明显升高。贮藏72 h 后，即食鸡肉中沙门氏菌的菌落总数由4.27 log CFU/g 下降至3.62 log CFU/g，降低了0.65 log CFU/g，这与FANG［17］、孙婷婷［18］的研究结果一致。唐晓阳［19］研究认为，在4 ℃条件下肉制品的变质速率减缓，主要因为低温条件下微生物体内的酶活性显著降低，同时微生物的生长速率降低，进而延长了微生物的生长延滞期［20］。FANG［17］等研究发现在低于最低生长温度的条件下，沙门氏菌会随着时间延长逐渐死亡。LI［21］等研究认为细菌遭受亚致死环境胁迫和低温双重条件的处理后，极容易进入“存活但不可培养（VBNC）”状态。因此，光动力处理组鸡肉中沙门氏菌在4 ℃贮藏条件下，极可能进入了VBNC 状态，具体的相关机制需要进一步研究。综上可得，低温条件下鸡肉中沙门氏菌生长速率降低，且与空白对照组相比，光动力处理组的细菌死亡速率更快。因此，光动力处理结合低温贮藏能够更大程度地保障食品安全风险水平。

3.3 光动力处理对即食鸡肉中沙门氏菌的影响

与空白对照组相比，光动力处理延缓了即食鸡肉中沙门氏菌生长达到稳定期的时间。进一步分析发现，16 ℃下即食鸡肉中沙门氏菌生长达到稳定期的时间比空白对照组延长了10 h，而25 ℃下则延长了5 h。在对数生长期，光动力处理组（L+C+）的菌落总数明显低于空白对照组（L-C-），但随着贮藏时间的进一步延长，所有样品的菌落总数未见明显差异。在4 ℃条件下贮藏72 h 后，光动力处理组鸡肉中沙门氏菌的菌落总数比空白对照组低0.3 log CFU/g。综上所述，光动力处理显著抑制了即食鸡肉中沙门氏菌的生长。CHEN［13］等人研究表明，姜黄素介导的光动力诱导了细胞结构的损伤与破裂，以及细胞内蛋白和DNA的损伤。在本实验中，光动力处理的沙门氏菌的生长速率明显较低，这主要是由于光动力处理诱导的受损细胞需要更长时间来修复自身的细胞膜、DNA、功能蛋白质等［22］。与空白对照组（LC-）相比，光动力处理组（L+C+）中亚损伤的沙门氏菌细胞需要更长的时间进行细胞修复进而进入正常的生长繁殖。在低温条件下，与空白对照组细胞相比，光动力处理组受损的细胞无法完成自身修复，因此，死亡率更高。当温度升高到25 ℃时，损伤的沙门氏菌的修复能力和增殖能力大大提高，并且能够在相对较短的时间来完成细胞修复。因此，在适当温度下，光动力处理可以减缓存活细菌的生长，降低病原菌可能因快速繁殖引起的疾病风险。

4 结论

本研究探究姜黄素光动力杀灭即食鸡肉中沙门氏菌的作用功效。将沙门氏菌接种在即食鸡肉上，探究光敏剂浓度、辐照剂量等因素对光动力作用功效的影响规律，优化构建高效杀灭即食鸡肉中沙门氏菌的技术参数，结果表明，当姜黄素浓度为200 μmol/L、辐照能量为33 J/cm2时，姜黄素光动力对即食鸡肉中沙门氏菌的失活作用明显，菌落数降低了0.9 log CFU/g。

将光动力处理组（L+C+）和空白对照组（L-C-）的样品置于4、16、25 ℃下贮藏培养，分析沙门氏菌的恢复生长情况，结果表明，在低温贮藏条件下，光动力处理组受损的细胞无法完成自身修复，死亡率更高；在适宜温度条件下，损伤的沙门氏菌需要更长时间完成自身修复进而开始生长繁殖。所以，光动力处理组（L+C+）的沙门氏菌的生长速率显著（P＜0.05）低于空白对照组（L-C-）。因此，光动力能够有效地杀灭即食鸡肉中的沙门氏菌，降低其生长速率，从而延长其货架期。