艾草精油Pickering乳液稳定性的研究

王曼笛，谢岩黎，李 倩，杨玉辉，马卫宾，孙淑敏

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

艾草具有抑菌[1]、抗氧化[2]、抗炎[3]等多种功效，在食品、药品、日用品中都有广泛的应用[4]，有巨大的开发价值。艾草挥发油即艾草精油(Artemisiaargyiessential oil)，是艾叶的主要功效成分之一，外观呈黄色、浅绿色澄清油状，具有浓烈的香味。然而艾草精油和其他精油一样，受空气、温度、光线等因素的影响很容易发生氧化，而且精油具有疏水性，导致其在应用上存在很多限制[5-6]。Pickering乳液是由固体颗粒代替传统的表面活性剂作为稳定剂制备的，具有更好的稳定性[7]。通过将精油制备成由固体颗粒稳定的Pickering乳液，可以有效解决精油的挥发性强、化学稳定性差和不溶于水的问题[8]。

水蒸气蒸馏法是应用最广泛的一种精油提取方法[9]，该法提取的精油成分丰富，杂质少。纤维素纳米晶因具有高结晶度、高纵横比、低密度和优异的机械性能被认为是水包油型Pickering乳液合适的稳定剂颗粒[10]。通常情况下，固体颗粒在乳液的油水界面上聚集，减少了系统的界面能量[11]。这些固体颗粒一旦附着在液滴的油水界面上，在静止条件下会永远停留在那里，是不可逆的。如果界面上有足够的颗粒，就可以形成一个有效的保护屏障，并且很容易实现对液滴凝聚的长期保护[12]。有关用纤维素纳米晶制备稳定的Pickering乳液的报道已经很多，Dong等[13]以丝光微晶纤维素为原料，在超声波作用下进行混合酸水解，制备了直径范围在30～60 nm的球形纤维素纳米晶，并用此纳米晶制备了稳定的Pickering乳液，该乳液在pH值、离子强度和较大温度范围内表现出高稳定性。另外有研究发现，将百里香精油制备成Pickering乳液，乳液的最小抑菌浓度为0.4 mg/mL，抗菌活性是纯精油的10倍，大大增强了百里香精油的抗菌效果[14]。

目前尚未有研究以纤维素纳米晶为稳定剂颗粒、艾草精油为油相制备稳定的Pickering乳液。因此，作者拟探讨pH值、超声时间、分散时间等因素对Pickering乳液稳定性的影响，旨在提高艾草精油Pickering乳液的稳定性，增强艾草精油的缓释效果，为开发绿色安全的植物源抑菌剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

艾草：从河南省汝阳县大虎岭森林公园采摘，采集艾草的地上部分，包括叶和茎，置于阴凉通风处风干。纤维素纳米晶：长度为200 nm，直径为10 nm，Zeta电势为-42 eV，接触角为14°，购自湖州闪思科技有限公司。无水硫酸钠、正己烷等试剂：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FW-80高速万能粉碎机：北京市永光明医疗仪器有限公司；SB-5200DT超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；SZCL-2智能控温磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；UV-6100S紫外可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司；DM2500正置荧光显微镜：德国Leica公司；FM200A高剪切分散乳化机：上海弗鲁克科技发展有限公司；AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；JY92-ⅡA超声波细胞破碎仪：宁波新芝生物科技股份有限公司；BT-9300ST激光粒度分布仪：丹东百特仪器有限公司。

1.3 超声辅助水蒸气蒸馏法提取艾草精油

参考文献[15]并稍做修改。将风干的艾草的地上部分粉碎，用蒸馏水浸泡，料液比为1∶15 g/mL，浸泡2 h，20 ℃超声20 min，放入圆底烧瓶中蒸馏6 h。蒸馏得到的艾草精油呈淡绿色，具有芳香气味，避光4 ℃保存。

1.4 不同pH值的艾草精油Pickering乳液的制备

参考文献[16]并稍做修改。具体步骤：将14.7 mL质量浓度为1 mg/mL的纤维素纳米晶水分散液的pH值调至某一指定数值(3、5、7、9、11)，缓慢地加入0.3 mL艾草精油，用高剪切分散乳化机分散60 s得到粗乳液，在冰浴条件下用超声波细胞破碎仪超声10 min(功率0.4 kW，超声5 s，间隙2 s)得到不同pH值的艾草精油Pickering乳液。

1.5 不同超声时间的艾草精油Pickering乳液的制备

将14.7 mL质量浓度为1 mg/mL的纤维素纳米晶水分散液的pH值调至7，缓慢地加入0.3 mL艾草精油，分散时间为60 s，超声时间为某一指定时间(0、5、10、15、20 min)，得到不同超声时间的艾草精油Pickering乳液。

1.6 不同分散时间的艾草精油Pickering乳液的制备

将14.7 mL质量浓度为1 mg/mL的纤维素纳米晶水分散液的pH值调节至7，缓慢地加入0.3 mL艾草精油，超声10 min，分散时间为某一指定时间(30、60、90、120、150 s)，得到不同分散时间的艾草精油Pickering乳液。

1.7 艾草精油Pickering乳液乳化稳定指数的测定

乳液稳定性指数(ESI)可以用来表示乳液的稳定性，ESI值越高乳液越稳定[17]。分别在0 h和24 h吸取制备的新鲜乳液(100 μL)，加入4.9 mL、1 mg/mL的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，涡旋30 s使溶液混合均匀后在500 nm处测定吸光度。ESI的计算公式如下[18]。

式中：A0为在0 h时测定的吸光度；A24为在24 h时测定的吸光度；ΔT为时间差，min。

1.8 艾草精油Pickering乳液的粒径

采用BT-9300ST激光粒度分析仪测定艾草精油Pickering乳液的体积平均粒径(D4,3)，D4，3为具有相同体积和粒子数的液滴的平均粒径。考虑到多次散射的影响，样品在室温下用超纯水稀释后进行分析。以超纯水为分散剂，设置折射率实部1.52，虚部0.1，介质折射率1.333。

1.9 荧光显微镜观察艾草精油Pickering乳液的微观结构

将14.7 mL质量浓度为3 mg/mL的纤维素纳米晶水分散液pH值调至某一指定数值(3、5、7、9、11)，缓慢地加入0.3 mL艾草精油，高剪切分散乳化机分散120 s，超声波细胞破碎仪超声20 min(功率0.4 kW，超声5 s，间隙2 s)得到稳定的艾草精油Pickering乳液。滴50 μL乳液在载玻片上，小心盖上盖玻片，防止有气泡产生，使用荧光显微镜在40倍物镜下观察0、7、14 d的乳液的结构。

1.10 艾草精油Pickering乳液的缓释效果

准确称取一定质量的艾草精油和乳液，置于75 ℃的烘箱中挥发一定时间，分别在6、12、24 h取出称质量，计算艾草精油和乳液的损失率[19]。

式中：mJ为精油初始质量，g；mJt为精油t时刻的质量，g；mR为乳液初始质量，g；mRt为乳液t时刻的质量，g；2%为乳液中艾草精油的质量分数。

2 结果与讨论

2.1 水相pH值对艾草精油Pickering乳液稳定性及粒径的影响

固相颗粒的表面电荷和润湿性可能会受到水相pH值的影响，这将改变颗粒在界面上的吸附以及乳液液滴之间的静电相互作用。水相pH值对乳液稳定性的影响如图1所示，在pH值为3时乳化稳定指数最高,为(26 365.14±1 422.61) min，颗粒温和地聚集在油滴表面，形成致密层，乳液稳定性最好。随着pH值从5增加到9，乳液的ESI从(18 780.66±2 274.71) min增加到(24 017.03±1 592.51) min。但过高的电荷密度会阻碍纤维素纳米晶在油水界面上的吸附，从而不能有效稳定乳液，导致pH值增加到11时，乳液的ESI又下降至(23 066.56±2 033.34) min。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图3、图5同。图1 水相pH值对乳液稳定性的影响Fig.1 Effect of aqueous phase pH value on emulsion stability

不同pH值的纤维素纳米晶水悬液对乳液粒径的影响如图2所示。可以看出乳液液滴的体积平均粒径(D4,3)随水相pH值的增加呈现先增大后减小的趋势。当水相pH值为3时，乳液的D4,3最小，为(0.82±0.02) μm;当水相pH值为5时，乳液液滴的D4,3增加到(1.24±0.07) μm;随后又在pH值为11时减小至(1.02±0.01) μm。

图2 不同pH值下艾草精油Pickering乳液的体积平均粒径Fig.2 Volumetric mean particle size of AAEO-PEs under different pH values

2.2 分散时间对艾草精油Pickering乳液稳定性及粒径的影响

分散时间对艾草精油Pickering乳液稳定性的影响如图3所示。当分散时间由30 s延长到150 s时，乳化稳定性呈现先增大后减小的趋势。在分散时间为120 s时，乳液的稳定指数升高至(9 438.84±41.17) min，继续增加分散时间到150 s，乳化稳定指数又下降至(5 052.16±237.67) min。由此可见，适当地延长分散乳液的时间，可提高乳液的乳化稳定性，但当分散时间进一步延长，纤维素纳米晶包裹油滴的壳体结构解聚的可能性增加[20]，使油滴释放，发生聚集，降低乳液稳定性。

图3 分散时间对乳液稳定性的影响Fig.3 Effect of dispersion time on emulsion stability

由图4可知，随分散时间的增加，乳液的D4,3呈现先减小后增大的趋势。在分散时间为30 s时，为(1.54±0.02) μm;当分散时间增加到120 s时，乳液的D4,3减小到(1.22±0.01) μm，随着分散时间继续增加到150 s，乳液的D4,3又增加到(1.31±0.02) μm。

图4 不同分散时间下艾草精油Pickering乳液的体积平均粒径Fig.4 Volumetric mean particle size of AAEO-PEs under different dispersion time

2.3 超声时间对艾草精油Pickering乳液稳定性及粒径的影响

超声时间对艾草精油Pickering乳液稳定性的影响如图5所示。当超声时间由5 min延长到20 min时，乳化稳定指数由(2 627.63±35.17) min提高至(8 920.54±509.61) min。由此可见，延长超声乳液的时间，有利于液滴充分分散、提高乳液的乳化稳定性。

图5 超声时间对乳液稳定性的影响Fig.5 Effect of ultrasound time on emulsion stability

由图6可知，随着超声时间的增加，乳液粒径减小。当超声时间由0 min延长到20 min时，乳液液滴的D4,3从(2.16±0.09) μm降低至(1.29±0.06) μm，这是因为超声处理能够将乳液中的不溶性物质破碎成细小的微粒, 从而有效降低乳液粒径及分散性[21]。

2.4 艾草精油Pickering乳液的显微结构

用荧光显微镜观察不同pH值的艾草精油Pickering乳液液滴的结构，如图7所示。由图7可以看出，在pH值为3时，储存0、7、14 d的乳液液滴粒径都很小，且分散性好，没有发生明显的液滴聚集凝结现象，乳液稳定性好，仍呈现均匀的白色牛奶状，没有明显分层。在储存7 d后，pH值为5、7、9的乳液有液滴聚集的现象，而且乳液也发生了明显分层。在储存14 d后，pH值为5的乳液絮凝情况最为严重，聚结范围最大，pH值为7、9、11的乳液液滴和储存7 d的相比，也发生更大程度的液滴聚集。由此可知，pH值为3的乳液稳定性最高，能保持14 d不发生分层，而pH值为5时的乳液乳化稳定性最低。

图6 不同超声时间下艾草精油Pickering乳液的体积平均粒径Fig.6 Volumetric mean particle size of AAEO-PEs under different ultrasound time

图7 不同pH值的艾草精油Pickering乳液的荧光显微与实物图像Fig.7 Physical pictures and fluorescence microscopy images of AAEO-PEs with different pH values

2.5 艾草精油Pickering乳液的缓释性分析

由图8可以看出，随着时间的延长，艾草精油的损失率不断增大。在24 h时，精油的损失率达到8.17%，而乳液中艾草精油的损失率为1.72%，显著降低(P<0.05)，说明以纤维素纳米晶为稳定剂制备的Pickering乳液对艾草精油有很好的缓释作用。

图8 艾草精油Pickering乳液的缓释效果Fig.8 Sustained-release effect of AAEO-PEs

3 结论

通过超声辅助水蒸气蒸馏法从艾草中提取了艾草精油，并将艾草精油制备成由纤维素纳米晶颗粒稳定的Pickering乳液，对影响乳液稳定性、粒径的因素及乳液的缓释效果进行了研究。研究发现，随着pH值从3增加到11，乳液稳定性先降低后升高，液滴粒径先增大后减小。乳液的稳定性随分散时间的延长，呈现先增大后减小的趋势，液滴粒径呈现先减小后增大趋势。超声时间会增加乳液的稳定性，超声时间由0 min延长到20 min时，乳液液滴的体积平均粒径减小了40.20%。当艾草精油体积分数为2%、纤维素纳米晶浓度为3 mg/mL、pH值为3、分散时间为120 s，超声时间为20 min时，制备的艾草精油Pickering乳液在室温下能保存14 d不分层。将艾草精油制备成乳液可以延缓精油的挥发，从而提高利用率, 延长使用时间，为开发新型艾草精油产品奠定基础。