石灰石改性硫磺材料深度脱氮除磷研究

罗黎煜，周立松，王梦良，张陈永，刘 波

（南京大学环境学院，污染控制与资源化研究国家重点实验室，江苏南京 210046）

氮和磷是导致水体富营养化的主要原因，而富营养化会导致水体多样性丧失、生态系统的退化、有毒藻类的爆发以及饮用水危机〔1〕。根据我国现有的污水排放标准（GB 18918—2002）和地表水质标准（GB 3838—2002），经污水处理厂处理后达到一级A的出水总氮、总磷浓度，仍远远无法满足地表Ⅳ类水标准〔2〕。传统的污水脱氮大多采用活性污泥法，但污水中缺少碳源，所以异养反硝化菌脱氮效果不佳，进而导致出水硝酸盐氮浓度高〔3〕。因此，自养反硝化工艺由于无需额外碳源等优点而得到大量关注与应用〔4-5〕。但传统的自养反硝化工艺对磷的去除效果较差，往往还需要化学除磷加以强化〔6〕。

利用石灰石作为碳源、硫磺作为电子供体的自养反硝化工艺（简称SLAD 工艺）在污水同步脱氮除磷方面具有较大优势〔7-8〕。该工艺同步脱氮除磷的原理如下〔8-9〕：

J.M.FLERE 等〔7〕设计了4个不同硫磺∕石灰石体积比的SLAD 反硝化滤池，对NO3--N 负荷介于600～700 g（∕m3·d）的模拟废水进行处理，发现去除速率可以达到384 g（∕m3·d）；当NO3--N 负荷高于600 g（∕m3·d）时，去除率开始严重下降；NO3--N 负荷 介 于175～225 g（∕m3·d）时，去除率较高，达到95%。Weili ZHOU 等〔10〕设计了硫磺∕石灰石体积比为2∶3 的SLAD 反硝化装置，用来处理进水NO3--N分别为10、40、70、100mg∕L的模拟废水，当进水NO3--N 处于低质量浓度时（10、40 mg∕L），去除率在HRT=3 h 时可以达到90%；当进水NO3--N 处于高质量浓度时（70、100 mg∕L），则需要较长的HRT，必须保证HRT 大于6 h。但是，要想使磷和钙更好地发生化学沉淀，需要水体的pH 呈碱性，最佳pH 为10，而SLAD 工艺的水体pH 大多在中性环境〔11-12〕。因此传统的SLAD 工艺除磷效果较低，很难超过50%〔8〕。此外，通常在SLAD 工艺中，硫磺和石灰石颗粒仅以一定的体积比（如1∶1、3∶1 等）简单混合〔13〕，为了避免堵塞，硫磺和石灰石的粒径通常为2～5 mm〔14〕，这使得SLAD 生物滤池反冲洗后容易分层。石灰石是SLAD 体系的碳源和碱度来源，传统SLAD 工艺使用的块状石灰石比表面积小，溶出速率有限，限制了碱度的补给，提供碳源的能力也较弱，导致SLAD 工艺脱氮速率较慢。因此，如果能制备出比表面积大的均质硫磺∕石灰石材料，将有效提高脱氮速率。

在SLAD 工艺中，需要将石灰石破碎至一定的粒径，破碎过程中会产生很多石灰石粉末。这些粉末因为粒径太小不能用作SLAD 填料，浪费了资源，因此制备均质硫磺∕石灰石材料还具有变废为宝、更广泛地利用石灰石资源的重要意义。

本研究在传统SLAD 工艺的基础上进行改良，以石灰石粉、硫磺和发泡剂NaHCO3为原料制备出一种改性硫磺材料，研究其同步脱氮除磷效果；探究生物滤池中微生物群落组成，为污水深度脱氮除磷提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料的制备

以石灰石粉（粒径＜0.15 mm）、硫磺为原材料，参考硫磺混凝土的制造方法〔15〕，制备出改性硫磺材料。具体过程如下：

（1）取一定比例的石灰石粉、硫磺，145 ℃油浴加热，使硫磺完全熔化；

（2）加入0～1.5% 的NaHCO3进行发泡，当NaHCO3比例为0 时，制备出的则为未发泡改性材料；

（3）通过搅拌使气泡均匀地分布在石灰石和液态硫磺的混合物中，然后冷却至室温。

硫磺∕石灰石体积比为3∶1 的不同NaHCO3比例的改性材料送往检测中心，采用GB∕T 9966.3—2020的标准进行测量，测得体积密度和真气孔率见表1。

表1 不同NaHCO3比例的改性材料性质Table 1 Properties of limestone-modified sulfur with different proportion of NaHCO3

由表1 可知，随着NaHCO3用量的增多，材料的密度降低，孔隙率变高，说明NaHCO3是有效的发泡剂。不加发泡剂的材料也有4%的孔隙率，是由于搅拌过程中空气进入了材料，并在冷却时停留在材料中形成气孔。

对发泡剂比例为0～1.5% 的材料进行XRF 分析，结果见表2。

表2 发泡剂比例为0～1.5%的材料XRF 分析结果Table 2 XRF analysis of limestone-modified sulfur with 0-1.5% NaHCO3

由表2 可知，改性材料的主要元素为S、Ca、Na等，Na 的含量随发泡剂比例的增加而增多。可知改性材料含有的主要物质为S 和CaCO3，还含有少量NaHCO3及其分解产物Na2CO3，证明材料在制备过程中未生成其他杂质成分，也就是说改性主要改变材料的物理性质而几乎不改变其化学性质。

1.2 生物滤池规格

生物滤池进水方式采用连续上流式，生物滤池内径为70 mm，高度为500 mm，填料的堆积高度为480 mm。生物滤池装填改性硫磺材料，装填体积为1.85 L，填料孔隙率为41%，有效容积为750 mL。填料粒径为2.5～4 mm。生物滤池有5 个侧边取样口，距布水板高度分别为90、170、250、330、410 mm，实验装置见图1。

图1 实验装置Fig.1 Schematic diagram of experimental device

1.3 进水水质与实验仪器

生物滤池进水为模拟一级B 出水，即在自来水中加入一定量的KNO3、KH2PO4，使进水TN、NO3--N分别为20 mg∕L，TP、PO43--P 分别为1 mg∕L。

实验仪器见表3。

表3 实验仪器Table 3 Experimental instruments

1.4 实验设计

通过批次实验，探究改性材料的最佳硫磺∕石灰石体积比。批次实验的过程如下：

准备一系列容积为60 mL 的批次管。每根批次管灭菌后依次加入6 mL 反应材料、50 mL 模拟的一级B 废水、3.5 mL 菌液，然后置于28 ℃的恒温振荡培养箱中。菌液为实验室驯化富集培养的硫自养反硝化菌。每根批次管视为一个样品，每2 d 取3 个平行样并测定NO3--N、NO2--N、PO43--P、pH、SO42-等水质指标。实验包括5 个实验组，硫磺∕石灰石体积比分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1。

选取批次实验中脱氮除磷效果较好的材料填入生物滤池。生物滤池挂膜启动6 个周期，每个周期时长为4 d，挂膜使用的微生物来自实验室培养的自养反硝化菌液。出水氮磷浓度稳定则视为启动成功。

生物滤池启动结束后在不同HRT 条件下运行。每天取样并测定进出水pH、NO3-、NO2-、SO42-、PO43--P等指标，每个HRT 条件运行至少30 d。在不同运行阶段取2 个生物滤池中部的填料，进行微生物群落组成分析。

1.5 微生物群落结构分析方法

从滤池取出填料样品，按照体积比1∶1 加入无水乙醇用以固定微生物，并保存至-20 ℃环境中。对于附着生长在填料上的微生物，采用超声的方法将其震离后，反复冲洗，收集冲洗液，经抽滤截留将微生物富集，然后按照污泥样品提取DNA 方法提取DNA。PCR实验采用TransGen AP221-02：Trans-Start Fastpfu DNA Polymerase，20 μL 反应体系。

将同一样本的PCR 产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR 产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus™Fluorometer（美国普洛麦格）对回收产物进行检测定量。使用NEXTFLEX®Rapid DNA-Seq Kit 进行建库：（1）接头链接；（2）使用磁珠筛选去除接头自连片段；（3）利用PCR 扩增进行文库模板的富集；（4）磁珠回收PCR 产物得到最终的文库。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平台进行测序。

2 结果与讨论

2.1 改性材料最佳硫磺∕石灰石体积比的确定

石灰石的含量决定了改性硫磺材料缓冲pH 的能力，而且石灰石还是反硝化菌的碳源，因此硫磺∕石灰石体积比对脱氮除磷效果有重要影响。有研究表明，在SLAD 体系中，当硫磺∕石灰石体积比为3∶1时，脱氮效果最佳〔16〕。因此在研究硫磺∕石灰石体积比对改性材料脱氮除磷的影响时，以3∶1 为中心设置实验组，各实验组脱氮除磷效果见图2。

图2 硫磺∕石灰石体积比对改性材料自养反硝化体系的影响Fig.2 Effect of sulfur∕limestone ratio on modified sulfur autotrophic denitrification system

整个批次实验中，没有NO2--N 被检测出，因此NO3--N 的去除可以被认为是TON（TON=NO3--N+NO2--N）的去除。由图2（a）可知，改性材料反硝化体系中的初始NO3--N 为20.4 mg∕L。在 第16 天 时，体积比为3∶1 的体系中TON 去除率最高，达到93.5%，去除速率为1.19 mg（∕L·d）。在J.M.Flere 等〔14〕的研究中，传统SLAD 体系当硫磺∕石灰石体积比为3∶1时脱氮速率最快，与本实验的结论一致。这是因为当硫磺和石灰石处于这一比例时，硫磺提供的硫源（电子供体）和石灰石提供的碳源都能满足微生物新陈代谢的需要，硫源和碳源匹配，而且石灰石提供的碱度能很好地中和反硝化产生的H+，达到最佳的反硝化效果。当硫磺∕石灰石体积比分别为1∶1 和2∶1时，硫磺占比较小，提供电子的能力比较弱。当硫磺∕石灰石体积比分别为4∶1 和5∶1 时，石灰石占比较小，释放碳源和缓冲pH 的能力比较弱。H.S.Moon 等〔17-18〕的SLAD批次实验的脱氮速率分别为0.677、0.96 mg（∕L·d），低于本实验的改性材料。

由图2（b）可知，反硝化体系的初始PO43--P 为1.24 mg∕L。硫磺∕石灰石体积比为3∶1 的体系除磷效果最好，在第16 天时的PO43--P 去除率为67.7%。结合图2（a）可知，TON 去除率越高的体系，PO43--P去除率也越高，这说明除磷的主要途径是和脱氮过程中产生的Ca2+生成沉淀。

总之，当硫磺∕石灰石体积比为3∶1 时，改性硫磺材料同步脱氮除磷性能最好。因此，后面的生物滤池实验中选取硫磺∕石灰石体积比为3∶1 的未发泡改性材料和发泡改性材料作为填料，探究其在生物滤池中的脱氮除磷性能。

改性材料脱氮效果好的原因之一是用于制备材料的石灰石都是非常细的粉末。这些粉末比表面积大，反应速率高，比传统SLAD 使用的块状石灰石更容易作为碳源被硫自养反硝化菌利用，缓冲pH 的能力也更强，因此在脱氮过程中具有优势。而且，石灰石粉末较大的比表面积提供了大量的附着位点对磷进行吸附，这使得改性材料具有很好的除磷性能〔19〕。

2.2 生物滤池脱氮除磷性能

用硫磺∕石灰石体积比为3∶1 的未发泡改性材料和发泡改性材料分别填入生物滤池，探究其脱氮除磷效果，结果见图3（图中第1～8 阶段的HRT 分别为12、6、3、2、1.5、1、0.5、0.25 h。为方便起见，后续论述中，未发泡材料简写为LMS，发泡材料简写为FLMS）。

图3 不同HRT 条件下两生物滤池脱氮除磷效果对比Fig.3 Nitrate and phosphate removal efficiency of two reactors under different HRT

由图3 可知，改性材料生物滤池在HRT 发生变化时可以保持较好的稳定性，在前150 d 脱氮除磷效果并未随着HRT 缩短而出现大幅下降。相对而言，FLMS 的脱氮除磷效果一直优于LMS。FLMS 在第1～6 阶段的NO3--N 去除率平均值保持在89%以上，PO43--P 去除率平均值保持在65%以上。LMS 在第1～5 阶段的NO3--N 去除率平均值保持在81%以上，PO43--P去除率平均值保持在46%以上。S.SENGUPTA等〔20〕用SLAD 生物滤池处理含氮废水，当进水NO3--N速率为120 mg（∕L·d）时，脱氮速率为100 mg（∕L·d），去除率约为83%，而本实验FLMS 滤池当HRT=2 h时进水NO3--N 速率高达240 mg（∕L·d），脱氮速率为221 mg（∕L·d），去除率约为92%。这说明改性材料生物滤池脱氮效果优于传统的SLAD 生物滤池，此外，其除磷能力也比袁玉玲等〔8〕的SLAD 生物滤池大大增强。

在FLMS滤池的第7～8阶段和LMS的第6～8阶段，由于进水NO3--N 负荷太高，氮磷去除率出现下降。LMS 滤池的最优HRT 为1.5 h，FLMS 滤池的最优HRT 为1 h，这也说明FLMS 作为填料优于LMS。

反硝化作用强弱的决定性因素之一是微生物的数量与活性。FLMS 有大量孔隙，这使得材料具有很大的比表面积，为微生物提供了更多的生长空间，比LMS 更有利于生物膜的生长，故脱氮效果更好〔21〕。此外，FLMS 制备过程中加入了NaHCO3，可以缓慢释放无机碳源供自养反硝化菌生长。

自养反硝化过程中硫作为电子供体被氧化成SO42-，因此出水中SO42-含量可以间接反映反硝化作用的强弱。由图3 可以看出，FLMS 生物滤池出水的SO42-浓度始终高于LMS 生物滤池。理论上每去除1 mg NO3--N 会产生7.54 mg SO42-，而本实验生物滤池SO42-产量略高于理论值（ΔSO42-∕ΔNO3--N 为8～16），但低于以前文献中的一些值（ΔSO42-∕ΔNO3--N为40～60）〔14〕，SO42-偏多可能是由于一些好氧菌利用水中微量溶解氧将硫磺氧化成了SO42-〔22〕。测定生物滤池沿程溶解氧发现，2 个生物滤池内溶解氧浓度变化几乎一样，这说明FLMS 滤池SO42-比LMS 滤池多是由于FLMS 滤池中反硝化作用更强，与两生物滤池内NO3--N 变化情况一致。生物滤池中PO43--P 的去除主要靠Ca2+的化学沉淀作用。FLMS 比表面积大，暴露在外的石灰石更多，因此反硝化产生的H+更容易与石灰石反应，产生较多的Ca2+；此外，FLMS 大量的微孔增加了材料对磷的吸附位点，使磷容易附着到材料表面，和Ca2+有充分接触的机会，从而提高除磷效率〔23〕。测定HRT=1.5 h 时2 个生物滤池进出水Ca2+浓度，结果见图4。

图4 HRT=1.5 h 时2 个生物滤池出水Ca2+Fig.4 Ca2+in effluent of two filters at 1.5 h HRT

由图4 可知，FLMS 滤池出水Ca2+浓度高于LMS，与除磷效果相一致。钙盐除磷的效果与水体pH 有着较大关联，碱性环境有利于磷的去除，pH=10 时除磷效果最好。FLMS 制备过程中加入了NaHCO3，在生物滤池运行过程中缓慢释放碱度，使水体pH 保持在弱碱性环境，有利于磷的去除〔24-25〕。由图3（c）可知，前5 个阶段FLMS 滤池出水pH 高于LMS 滤池，与除磷效果相一致。

2.3 生物滤池填料表面微生物分析

2.3.1 微生物物种多样性

研究微生物多样性常用的方法有Alpha 多样性，Alpha 多样性是指一个特定生态系统内的多样性，它反映了群落内物种间通过竞争资源或利用同种生境而产生的共存结果，常用的度量标准有chao、shannon、ace、simpson、coverage 等〔26〕。Simpson指数反映了群落的均匀度，其值越大则表明均匀度越高。Shannon 指数反映了群落的物种数目和均匀度，物种数越多、均匀度越高，shannon 指数越大〔27-28〕。分别以F1～F4 表示FLMS 滤池HRT 分别为12、6、3、1.5 h 的填料，L1～L4 表示LMS 滤池HRT 分别为12、6、3、1.5 h 的填料，其微生物Alpha 多样性见表4。

表4 填料表面微生物Alpha 多样性Table 4 Alpha diversity on the surface of fillers

由表4 的simpson 指数可知，FLMS 滤池填料的微生物种类分布更均匀，群落均匀度随滤池运行时间的延长先降低后升高；由表4 的shannon 指数可知，LMS 滤池中微生物种类更多，微生物种类数随滤池运行时间的延长先增加后减少。

2.3.2 微生物群落组成分析

LMS 和FLMS 滤池填料表面微生物门水平和属水平群落组成分别见图5 和图6。

图5 填料表面微生物门水平群落组成Fig.5 Microbial community on the surface of fillers at Phylum level

图6 填料表面微生物属水平群落组成Fig.6 Microbial community on the surface of fillers at Genus level

由图5 可知，Proteobacteria（变形菌门）和Campilobacterota 是占优势的门。Proteobacteria 门包括Thiobacillus 和Halothiobacillus 等，Campilobacterota门包括Sulfurimonas 等，都是常见的硫自养反硝化菌，这也解释了滤池能够高效脱氮的原因。启动菌液中主要含Campilobacterota，运行后则以Proteobacteria 为主。

由图6 可知，接种菌液中的微生物以Sulfurimonas为主，丰度高达85.12%，此外还有10.86% 的Halothiobacillus和0.56%的Thiobacillus，这3个菌属均属于硫自养反硝化菌，三者丰度之和高达96.54%，说明实验室硫自养反硝化菌驯化培养非常成功。由图6 可以看出，HRT 为12 h 时2 个生物滤池中的优势菌属都是Sulfurimonas，在LMS 和FLMS滤池中丰度分别为66.97%和66.13%。Sulfurimonas是一种化能自养菌，可以利用硫作为电子供体、NO3-作为电子受体进行反硝化〔29-30〕。除了Sulfurimonas外LMS 滤池中大量存在的菌属还有Thiobacillus，丰度为16.89%。Thiobacillus也是一种常见的自养反硝化菌，可以在氧化硫元素的同时将NO3-、NO2-及其他氮氧化物还原成N2〔31-32〕。在FLMS 滤池中大量存在的另一种菌属是Halothiobacillus，丰度为20.19%。Halothiobacillus也具有硫自养反硝化的功能，它和Thiobacillus相比具有的优势是对盐的耐受性很强〔33-34〕。发泡材料制备过程中加入了NaHCO3，会导致水体碱度上升。Halothiobacillus比Thiobacillus更能适应高碱度的水体，因此在FLMS 滤池中占优势。总之，2 个生物滤池中的微生物群落都主要由硫自养反硝化菌构成，FLMS 滤池中硫自养反硝化菌的丰度更高，这是因为FLMS 材料提供碳源和碱度的能力更强，更有利于自养反硝化脱氮。

由图6 还可以看出，随着HRT 的缩短，Sulfurimonas的丰度呈下降趋势，而Thiobacillus的丰度呈上升趋势。当HRT 为1.5 h 时，FLMS 和LMS 滤池中Thiobacillus丰度分别为83.93%和79.66%，几乎没有Sulfurimonas。以上结果说明HRT 从12 h 到1.5 h 的过程中，滤池内发生了以Sulfurimonas为优势菌属向以Thiobacillus为优势菌属的演替过程。这是因为滤池运行初期存在启动阶段残留的Na2S2O3·5H2O，推 测Sulfurimonas更适合以Na2S2O3·5H2O 为硫源而Thiobacillus更适合以硫磺为硫源。Halothiobacillus在FLMS 滤池内呈减少趋势，当HRT为3 h 时几乎消失，这是因为NaHCO3作为碳源和pH缓冲物质被逐渐消耗，滤池内水体盐度逐渐下降。整个运行过程中滤池内的主要微生物一直都是硫自养反硝化菌，这保证了滤池始终具有良好的脱氮除磷性能。

除了硫自养反硝化菌之外，生物滤池内丰度较大的菌属还有Desulfocapsa、Cloacibacterium、Simplicispira、Ciceribacter等。其中，Desulfocapsa可以利用CO2等无机物作为碳源，将SO42-还原成硫化物，这一过程可在一定程度上降低出水中SO42-的浓度，减少反硝化副产物〔35〕。Cloacibacterium、Simplicispira、Ciceribacter等菌属都含有一些异养反硝化菌，它们的存在也可以为NO3--N 的去除做出一定的贡献〔36-38〕。

3 结论

（1）本研究制备的改性材料具有较好的脱氮除磷性能，其中硫磺∕石灰石体积比为3∶1 的材料脱氮除磷性能最佳。

（2）改性材料生物滤池对HRT 的变化有很强的适应性，发泡改性材料脱氮除磷性能优于未发泡改性材料。当进水NO3--N 为20 mg∕L、PO43--P 为1 mg∕L时，在HRT 从12 h 缩短至1 h 的过程中，发泡改性材料的NO3--N 去除率保持在89%以上，PO43--P 去除率保持在65%以上。较高的孔隙率和缓慢释放的碱度是发泡材料高效脱氮除磷的重要原因。

（3）生物滤池中的微生物群落主要由硫自养反硝化菌构成，运行过程中滤池内发生了以Sulfurimonas为优势菌属向以Thiobacillus为优势菌属的演替过程，这2 个菌属都是硫自养反硝化菌。