生物传感器在食源性金黄色葡萄球菌快速检测中的应用

刘 慧，曾祥权，蒋世卫，周玉春，黄 华

（1.北京市产品质量监督检验院，北京 101300；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）呈圆形，大小约为1 μm，是一种兼性厌氧、无孢子形成的革兰氏阳性菌。该菌广泛分布于自然界中，并在低温、干燥、高盐等不利的生存环境下仍能生长繁殖。在人体中主要存在于皮肤、黏膜以及鼻咽部，有研究表明30%～80%的人群是金黄色葡萄球菌的携带者[1]。作为一种潜在的病原体，金黄色葡萄球菌不仅可以引起皮肤感染，还极易通过各种途径和方式污染食品从而引起危及生命的感染，如心内膜炎、败血症、肺炎、骨髓炎和关节炎等[2]，对食品安全和人类健康造成严重威胁。除感染外，金黄色葡萄球菌还可通过产生毒素来诱发食物中毒，主要症状包括呕吐、腹泻和腹部绞痛，严重时还会出现头痛、肌肉痉挛甚至休克等[3]。金黄色葡萄球菌分泌的毒素主要包括肠毒素（Staphylococcus aureusenterotoxin，SE）（SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SHE和SEI）、中毒性休克综合征毒素1及白细胞介素[4]。其中，SEA热稳定性强，对低pH值、干燥和冷冻等不利环境具有较强的抵抗能力，是引起食物中毒的最常见毒素[5-6]。目前，金黄色葡萄球菌及其毒素正不断威胁人们的生命健康，与此相关的食物中毒报道层出不穷。根据美国疾病预防控制中心的报告显示，由金黄色葡萄球菌是引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌[7]；在我国，根据2015年食源性疾病监测数据显示，由金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病占食源性疾病暴发总数的12.6%，是造成食源性疾病的第三大致病菌[8]；而在世界其他地方，每年也会发生多起该类食品安全事件，给公共医疗卫生造成巨大压力。

此外，随着抗生素在动物养殖和医疗领域的使用，病原体在抗生素的选择压力下不断进化出新的致病菌。特别是甲氧西林于1959年被引入用于治疗耐青霉素的金黄色葡萄球菌引起的感染后，出现了耐甲氧西林的“超级耐药细菌”（methicillin-resistantS.aureus，MRSA）[9]。MRSA是一种人类病原体，可导致医院获得性感染和社区获得性感染，对此尚缺乏有效治疗手段，目前已成为一个重大的公共卫生问题。值得强调的是，MRSA已被从世界各地的肉、鱼、牛奶及相关乳制品等食物中分离出来，尤其是食用动物及其相关制品[10-13]。有研究表明，屠宰携带MRSA的动物或感染MRSA的人员处理食物时均可造成食品污染，进而对消费者的健康造成潜在危害[14-16]。

综上所述，对食品中的金黄色葡萄球菌进行检测，对降低突发公共卫生事件发生风险及确保食品安全具有重要的现实意义。目前，用于金黄色葡萄球菌检测的分析方法仍以传统的分离培养和生化鉴定方法为主。该方法操作复杂繁琐、检测周期长且灵敏度低，无法满足快速检测要求。因此，迫切需要探索更加便捷、快速、准确、安全的新型检测技术以实现对金黄色葡萄球菌的实时监控。生物传感器是将生物信号与物理或化学换能器结合并转化为可监测信号的一类小型、便捷的分析装置，具备操作简单、分析速度快，可在线检测等优点，有利于实现金黄色葡萄球菌的现场实时检测。本文就各类生物传感器的基本原理及其在金黄色葡萄球菌快速检测中的应用进行了详细阐述，以期为研发基于生物传感器技术的金黄色葡萄球菌检测方法提供参考依据。

1 传统检测方法

常规培养方法是用于检测金黄色葡萄球菌的传统检测方法，其主要依据各种行业标准和国家标准，这些标准检测方法可靠性高、成本低，但灵敏度较低且检测周期长，通常需要3～5 d才能出结果，不能满足对食源性金黄色葡萄球菌快速、及时、灵敏的检测要求，不利于食品的监督管理和疾病预防。因此，近年来各种快速检测技术不断发展，并表现出传统方法所不具备的明显优势，如基于抗原/抗体特异性结合的免疫分析法、基于核酸的分子生物学方法以及基于光谱的仪器分析方法等[17-19]。这些检测方法可将检测时间从数天缩短至数小时，但仍存在一定局限性：如免疫分析方法特异性强，但有耗时长、存在交叉反应等潜在的缺点[20]；核酸分析方法基于对金黄色葡萄球菌的特异核酸序列进行扩增或识别，优点是准确性和灵敏度更高，但需要专业的仪器设备和操作人员，且样品制备工作繁琐、制备时间冗长，主要用于实验室分析，不适合现场检测[21]；光谱技术可以无损测定样品中的金黄色葡萄球菌，但是复杂的食品基质可能影响其稳定性[22]。另外，在发展中国家，高成本和有限的资源也是限制大多数快速检测技术推广应用的关键因素。因此，持续开发快速、可行的快速检测方法对低成本检测金黄色葡萄球菌和MRSA具有重要意义。生物传感器在快速检测领域具有较好的应用前景，本文将详细阐述生物传感器技术在金黄色葡萄球菌快速检测中的最新研究进展。

2 生物传感器法

生物传感器是由识别元件、信号转导元件及信号放大装置构成的一种便携式分析检测工具。其工作原理是基于生物活性材料（如抗原、抗体、酶、核酸、适配体、噬菌体、细胞、组织、微生物等）的敏感识别元件（生物感受器）与待测目标物发生生化反应产生浓度信号，经由基于光学、电化学、压电（piezoelectric，PZ）、磁力和温度等一种或多种技术结合而设计成的换能器（信号转导元件）转换成可定量分析的光、电等信号，再经信号放大装置放大输出，从而获得目标分析物的数量和浓度信息[23]，如图1所示。目前，生物传感器在农业、医药、食品工业和环境监测中得到广泛应用并逐渐形成了商品化体系[24-26]。尤其在食源性致病菌检测领域，生物传感器被视为用于食品加工常规监测及应对突发紧急状况的重要工具[27]。

图1 生物传感器的基本组件[23]Fig.1 Basic components of biosensors[23]

2.1 电化学生物传感器

电化学生物传感器是所有生物传感器中最具代表性的一类，鉴于高灵敏度、高通用性及较低成本等特点而受到人们的广泛关注。其检测原理基于抗原/抗体、酶、核酸、适配体等生物识别元件捕获待测目标物后会引起传感器表面发生电流、阻抗、电位或电导等参数的变化，通过监测这些化学信号变化可对目标分析物的浓度做出定量分析[23]。根据观察到的不同参数变化，又可将电化学生物传感器细分为电流型生物传感器、阻抗型生物传感器、电位型生物传感器及电导型生物传感器。表1列出了基于不同模式的电化学生物传感器在金黄色葡萄球菌检测中的应用。

表1 不同电化学生物传感器在金黄色葡萄球菌检测中的应用Table 1 Application of different electrochemical biosensors in detection of Staphylococcus aureus

2.1.1 电流型生物传感器

电流型生物传感器的工作原理是通过测量电极表面发生的生化反应引起的电流变化来确定目标物的浓度，即目标分析物的浓度与生物传感器的电流响应成正比[20]。近年来，已开发出多种电流型生物传感器应用于金黄色葡萄球菌的检测（表1）。常用的电流型生物传感器主要以免疫学检测为基础，由于抗原/抗体生物分子本身不具备电活性，一般需要对抗原/抗体进行标记，碱性磷酸酶是常用的酶标记。Escamilla-Gómez等[29]利用巯基丙酸在金电极表面自组装单分子层上固定金黄色葡萄球菌抗体和酪氨酸酶作为免疫传感平台，测定时金黄色葡萄球菌和碱性磷酸酶标记的二抗会与电极上固定化抗体的结合位点发生竞争性免疫反应，碱性磷酸酶水解产生的苯酚在酪氨酸酶的作用下氧化为邻醌，将其作为安培法的监测信号可实现在较低的正电势下灵敏地检测金黄色葡萄球菌，该免疫传感器的检出限为1.7×105CFU/mL；此外，通过对待测样品进行加热处理以破坏金黄色葡萄球菌的细胞壁，可将检出限降低至2.3×103CFU/mL。Escamilla-Gómez等[30]还报道了另一种利用3,3’-二巯基丙酸（N-琥珀酰酯）作为交联剂将抗体共价固定在金电极表面构建的电流型免疫传感器用来检测金黄色葡萄球菌的方法，该方法的线性范围为1.3×103～7.6×104CFU/mL，检出限低至3.7×102CFU/mL。de Ávila等[31]基于功能化磁珠（magnetic beads，MBs）和金丝网印刷电极（gold screen-printed electrodes，Au/SPEs）的特性，开发了一种可用于生乳中金黄色葡萄球菌特异性检测和定量分析的一次性安培型磁免疫传感器（图2），即将抗体固定在经金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白A（ProtA）修饰的功能化免疫磁珠上，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的ProtA和金黄色葡萄球菌会与功能化免疫磁珠上的抗体发生竞争性免疫反应，通过监测辣根过氧化物酶催化H2O2的氧化还原反应引起的电化学信号变化可实现金黄色葡萄球菌的检测。该方法分析时间短（2 h），可用于现场快速检测，且选择性良好、灵敏度高，生乳中检测限低至1 CFU/mL。Majumdar等[32]采用预包覆聚乙烯亚胺层的戊二醛交联剂将抗体固定在铂电极表面上，开发了一种用于检测不同食品样品（牛奶、奶酪和肉制品）中金黄色葡萄球菌的安培免疫传感，该方法的检出限可低至10 CFU/mL。这些电化学生物传感器的一个共同缺点是不同的电活性化合物会产生假电流值从而对结果造成潜在干扰。然而，可通过使用选择性膜，根据质量或电荷控制化合物进入电极的途径来克服这一缺点[41]。

图2 金黄色葡萄球菌安培型磁免疫传感器[31]Fig.2 Schematic diagram of magnetoimmunosensor to detect S.aureus[31]

2.1.2 阻抗型生物传感器

阻抗型生物传感器灵敏度高、成本低、功耗低、测定简单，近年来广泛应用于食源性致病菌的检测[42-43]。该类型的生物传感器主要基于两种原理，一种是病原菌生长产生的代谢产物可引起电导率变化；一种是病原菌与电极表面发生相互作用会引起阻抗变化。目前，电化学阻抗谱（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）由于体积小、成本低、检测快速等优点，已成为应用最广泛的生物传感器技术。近年来，有关阻抗法检测食源性病原菌的方法已有很多文献报道，但只有少数专门针对金黄色葡萄球菌检测（表1）。Tan Fei等[34]通过将抗体固定在氧化铝纳米多孔膜修饰电极上构建了一种微流控免疫传感器，抗体与金黄色葡萄球菌的特异性结合会引起电极表面阻抗的变化，利用电化学阻抗谱可快速检测金黄色葡萄球菌的浓度，其分析时间短（2 h）、交叉反应性极小，检测灵敏度高达102CFU/mL。Braiek等[35]使用3-巯基丙酸在金电极自组装单分子层上固定抗体，并利用电化学阻抗谱检测金黄色葡萄球菌，该方法特异性和重现性良好，检出限为10 CFU/mL。Bekir等[37]同样采用自组装单分子层方法将抗体固定在修饰的金电极表面，以亚铁/亚铁氰化物作为氧化还原探针监测固/液界面的电荷转移电阻，并利用阻抗谱技术建立了一种可用于检测应激条件下和复苏状态的金黄色葡萄球菌的阻抗免疫传感器方法，该方法稳定性和重现性良好，线性范围为101～107CFU/mL，检出限低至10 CFU/mL，即使在应激条件下也能检测到食品样品中的金黄色葡萄球菌。与其他电化学生物传感器技术相比，电化学阻抗谱作为一种无标签的检测方法，其检测限仍然不够低[44]。

2.1.3 电位型生物传感器

电位法是电化学检测食源性病原体方法中最不常用的一种，通常使用高阻抗电压表测量在零电流流动条件下两个使用电极（工作电极和参比电极）的离子性质变化所引起的电势差[45]。电位型生物传感器检测食源性病原体的原理主要是基于电解液中玻璃电极的pH值或离子浓度变化。Zelada-Guillén等[39]以适配体作为识别元件，单壁碳纳米管作为离子-电子电位传感元件，构建了一种无标记的金黄色葡萄球菌检测方法。该生物传感器分别采用共价结合和非共价吸附两种方法对碳纳米管进行适配体功能化，结果表明，非共价功能化的生物传感器具有更高的灵敏度，检出限为8×102CFU/mL。Hernández等[40]通过在石墨烯修饰的电极上连接DNA适配体作为金黄色葡萄球菌的检测探针，首次构建了新一代电位型生物传感器，该方法选择性强、重现性好，并且能在非常短的响应时间内提供超低的检测限（1 CFU/mL）。

2.2 光学生物传感器

继电化学检测方法之后，光学生物传感器因其灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点逐渐发展起来并广泛应用于金黄色葡萄球菌的检测（表2）。此外，利用光纤和集成光学传感器的优势还可实现可视化检测分析。光学检测技术主要分为无标签检测和近实时检测两大类，根据吸收、反射、折射和色散等参数还可进一步分为比色生物传感器、荧光生物传感器、表面等离子体共振（surface plasmon resonance methods，SPR）生物传感器、表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy methods，SERS）生物传感器等。

表2 不同光学生物传感器在金黄色葡萄球菌检测中的应用Table 2 Application of different optical biosensors in detection of Staphylococcus aureus

2.2.1 比色生物传感器

比色法是基于待测样品对光的选择性吸收而产生的可视化颜色变化或借助光谱学仪器检测光学变化的一种分析方法。利用比色方法独特的光学特性可实现对金黄色葡萄球菌的快速检测。同时，纳米颗粒的引入在金黄色葡萄球菌检测中发挥了重要作用。以抗原抗体特异性结合的免疫学分析方法与生物传感器相结合，可实现对金黄色葡萄球菌的高特异性和高灵敏度检测，比色生物传感器可进一步分为基于平面基板和溶液测量两种形式。平面基板格式通常使用纸或玻璃作为基板，其代表类型是侧向免疫分析法（lateral flow immunoassay，LFA）。Li Chenzhong等[46]基于LFA原理开发了一种多重免疫盘生物传感器，可特异性检测金黄色葡萄球菌，该传感器上的免疫盘被金纳米粒子修饰作为基板，并在金纳米粒子上固定抗体作为生物识别元件，利用金纳米粒子的光学特性，在给样5 min内通过测试区域的颜色变化可检测金黄色葡萄球菌，检出限为5.0×102～5.0×103CFU/mL。基于LFA的比色传感器具有分析迅速的优点，但灵敏度较低，通常仅提供半定量结果[68]。而利用胶体金纳米颗粒（Au nanoparticles，AuNPs）等开发的基于溶液格式的比色传感器具有能够对大容量样品进行简单快速分析的优点。Sung等[47]使用牛血清白蛋白包被磁性纳米颗粒（magnetic nanoparticles，MNP），并将其与AuNP和金黄色葡萄球菌抗体吸附组合成纳米复合材料，利用这种新型的抗体/AuNP/MNP纳米复合材料研究了基于溶液测定的比色生物传感器在磷酸盐缓液（phosphate buffered saline，PBS）和牛奶中检测金黄色葡萄球菌的效率。与没有吸附AuNP的抗体偶联MNPs相比，抗体/AuNP/MNPs的捕获效率显著提高。利用AuNP的优势，该传感器在PBS和牛奶中的检出限分别为1.5×103CFU/mL和1.5×105CFU/mL。Liu Pei等[49]将金黄色葡萄球菌特异性融合蛋白pVIII的特异性识别能力与半胱氨酸（cysteine，CS）修饰的AuNPs（CS-AuNPs）的独特SPR光学特性相结合，开发了一种新型的双功能金纳米探针（CS-AuNPs@fusion-pVIII）用于金黄色葡萄球菌的比色检测。该比色生物传感器分析时间短（30 min）、选择性强、灵敏度高，实现了检测限低至19 CFU/mL金黄色葡萄球菌的检测。Suaifan等[50]基于金黄色葡萄球菌蛋白酶对特定肽底物具有水解活性的原理开发了一种新型纸基生物传感器，以特定肽底物作为生物识别元件，并将其固定在纳米磁珠和纸质支持物顶部的金电极表面之间，当测试样品（纯培养和食品样品）滴至传感器表面时，可通过肉眼检测颜色变化，并使用图像处理软件进行分析以进行定量测定。该方法无需昂贵的专业设备，操作更简便，符合现场实时检测的要求，在纯培养和接种的食品样品中金黄色葡萄球菌检测限分别为7 CFU/mL和40 CFU/mL。

2.2.2 荧光生物传感器

当某种物质经过一定波长的入射光（通常是紫外线）照射，吸收光能后进入激发态，处于激发态的原子发生能级跃迁从而发出各种可见光，这种光学现象称为荧光。荧光生物传感器是一种功能强大且相对容易构建的生物传感技术，通常将荧光生物识别元件与光学传感器相结合，测定时需要使用荧光染料、量子点（quantum dot，QDs）或其他具有荧光效应的材料作为标记物。另外，基于荧光发光原理，利用物质之间的相互作用产生的催化荧光、荧光猝灭、荧光增强等现象可实现对食源性病原菌的检测。Xue Xiuheng等[51]以巯基乙酸为配体制备高发光水溶性量子点（CdSe QDs），将其为荧光标记物共价偶联靶标菌，并利用荧光光谱仪建立了可同时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌快速检测的细菌计数法，该方法的最低检测限为102CFU/mL。Wang Xiaole等[55]构建了多色镧系元素掺杂的时间分辨荧光（time-resolved fluorescence，TEFL）生物传感器，用于检测鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）和金黄色葡萄球菌（图3）。该传感器将针对鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌特异性的适配体修饰在NaGdF4:Eu和NaYF4∶Ce/Tb纳米材料上作为信号探针，并将两者的适配体修饰在Fe3O4磁性纳米粒子上用于捕获探针；加入样品后，适配体与靶标菌结合从而形成既带有荧光纳米材料又带有磁性纳米颗粒的“夹心”式复合物，经过磁分离作用后，对复合物的荧光进行检测以实现对这两种病原菌的定量检测，结果表明该方法对PBS中金黄色葡萄球菌的检测限为20 CFU/mL，在加标牛奶中的检测也显示出其优异的分析性能。Zuo Peng等[56]利用适配体功能化氧化石墨烯开发了一种聚二甲基硅氧烷/纸/玻璃混合微流体系统，可一次性对包括金黄色葡萄球菌在内的多种病原菌进行多重检测。测定时，荧光标记适配体与金黄色葡萄球菌发生特异性结合并从氧化石墨烯中释放出来，导致荧光强度增强，样品中金黄色葡萄球菌浓度与荧光强度呈线性关系，该方法的检测限为8×102CFU/mL。He Xiaoxiao等[57]构建了一种双色流式细胞术可快速灵敏地检测金黄色葡萄球菌，该方法以适配体修饰的荧光二氧化硅纳米颗粒（FSiNPs）作为捕获探针，在适配体特异性捕获金黄色葡萄球菌并使用SYBR Green I染料进行核酸染色后，利用双色流式细胞仪进行检测。此荧光生物传感器综合利用了适配体的高特异性、FSiNPs标记的信号放大性及双色流式细胞仪假阳性低的优势，检测灵敏度高，在测定缓冲液和牛奶样品中金黄色葡萄球菌的检测限分别低至1.5×102CFU/mL和7.6×102CFU/mL。Shangguan Jingfang等[59]在另一项研究中提出了正向介电电泳（positive dielectrophoresis，pDEP）驱动在线富集与适配体-荧光二氧化硅纳米颗粒标记相结合的方法，用于快速、灵敏地检测微流体通道中的金黄色葡萄球菌。该方法将金黄色葡萄球菌适配体固定在氯丙基修饰的荧光二氧化硅纳米颗粒上形成适配体/荧光二氧化硅纳米颗粒偶联物，并以此作为纳米探针；该探针与样品中的金黄色葡萄球菌一起孵育后被直接引入基于pDEP的微流体系统，通过在pDEP频率区域施加交流电压，纳米探针标记的金黄色葡萄球菌向最强电场区域移动并在电极间隙中富集，使用荧光显微镜成像系统可检测富集的金黄色葡萄球菌。该检测方法得益于适配体的高特异性、荧光二氧化硅纳米颗粒标记的信号放大性以及pDEP的在线富集性，检测灵敏度高，在去离子水和人工接种水样中金黄色葡萄球菌的检测限分别为9.3×101CFU/mL和2.7×102CFU/mL。

图3 同时检测鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的时间分辨荧光生物传感器[55]Fig.3 Time-resolved fluorescence biosensor for simultaneous detection of S.typhimurium and S.aureus[55]

2.2.3 表面等离子体共振生物传感器

SPR是入射光以特定的共振角度撞击到金属膜-液体界面上，金属膜内由于自由电子共振增强了对入射光的吸收，从而导致折射率发生改变的一种物理光学现象。SPR传感器是基于SPR光学特性的超灵敏检测仪器，测定时目标分析物与固定在SPR传感器上的生物识别元件相结合从而引起金属膜表面折射率变化，进而导致SPR角度发生位移，通过目标分析物含量与SPR角度变化之间的线性关系可定量分析样品中金黄色葡萄球菌的浓度[69]。在光学检测方法中，基于SPR的方法是检测金黄色葡萄球菌最常用的方法。表2总结了用于检测金黄色葡萄球菌的SPR生物传感器。Subramanian等[60]利用SPR传感器表面的硫醇自组装单分子层固定金黄色葡萄球菌抗体，捕获抗体与金黄色葡萄球菌特异性结合引起SPR角度的变化，以此检测金黄色葡萄球菌，检测限为105CFU/mL。除抗体外，其他灵敏、耐用且易于获得的生物识别元件（如裂解噬菌体）也在SPR生物传感器中得到了应用。Balasubramanian等[62]首次报道了以裂解溶菌体作为高度特异性和选择性生物识别元件，使用SPR SPREERA™传感器作为检测平台，实现了对低浓度金黄色葡萄球菌的无标签检测，检测限为104CFU/mL。Tawil等[63]采用新型特异性噬菌体作为生物识别元件建立的SPR方法可以在不到20 min的短时间内完成对MRSA的无标记、实时、特异和快速检测，检测限为103CFU/mL。目前，已报道的关于MRSA的耐药机制是其产生独特的青霉素结合蛋白2a，该蛋白对β-内酰胺的亲和力较低。基于此，Tawil等[64]在另一篇报道中采用自组装单分子层修饰的金电极固定抗青霉素结合蛋白2a的抗体，用于检测和区分MRSA，该方法检测时间短（20 min内），检测限低至10 CFU/mL。SPR是光学生物传感器中最常用的方法，具有无标记检测，多重分析和定量功能的优点。但是，SPR生物传感器在检测整个微生物细胞等相对较大的目标物时存在一定缺点，如灵敏度相对较低。此外，SPR生物传感器还需要复杂、大型且昂贵的设备来进行实验室检测。

2.2.4 表面增强拉曼光谱生物传感器

SERS的检测是基于在合适频率的入射光照射下，吸附在SERS基底上的分子与纳米金属表面等离子体发生等离子共振而引起分子拉曼信号显著增强的原理。SERS基本上是拉曼光谱和纳米技术两种技术的结合，可弥补传统拉曼光谱检测灵敏度低的不足，是一种极具潜力的快速、无损检测技术。Zhang Hui等[66]利用金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的适配体分别对Fe3O4磁性金纳米颗粒和经拉曼分子（巯基苯甲酸和5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB））标记的金纳米颗粒进行功能化修饰，一个作为捕获探针，一个作为SERS信号探针，基于适配体与病原菌特异性结合的原理，建立了一种夹心式的适配体生物传感器检测平台，可用于同时检测金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌（图4）。该SERS生物传感器分析时间短（3 h）、选择性强、灵敏度高，检测限为35 CFU/mL。Wang Junfeng等[67]采用相同的策略构建了另一种新型夹心式适配体生物传感器检测平台，其在DTNB标记分子修饰的金纳米颗粒外包覆适当厚度的DTNB标记分子修饰的银壳层，合成金银核壳等离子纳米颗粒（AuNR-DTNB@Ag-DTNB），作为SERS信号增强探针。该方法可实现金黄色葡萄球菌的单细胞检测，检测限低至10 细胞/mL，线性范围为101～105细胞/mL。尽管目前已有SERS生物传感器应用于食源性病原菌检测的相关报道，但其在实际应用中仍存在一定局限性，如定量能力有限以及对光学显微镜、激光、单色仪等复杂专业设备的依赖性强[70]。

图4 同时检测金黄色葡萄球菌与鼠伤寒沙门氏菌的SERS生物传感器[66]Fig.4 Surface-enhanced Raman biosensors for simultaneous detection of S.aureus and S.typhimurium[66]

2.3 质量生物传感器

质量（mass-based）生物传感器的测定原理是利用共振现象感知传感器表面质量的微小变化，共振现象可以通过频率、振幅、相位等多种参数来测量。质量生物传感器作为一种无标记型传感器，具有成本低且相对容易操作等优点，但与电化学和光学生物传感器相比，其在食源性病原体检测领域的应用仍十分有限。根据换能器的不同类型，质量生物传感器可进一步分为PZ生物传感器和磁弹性（magnetoelastic，ME）生物传感器。

表3列出了部分关于PZ生物传感器在金黄色葡萄球菌检测方面的研究报道。

表3 不同质量学生物传感器在金黄色葡萄球菌检测中的应用Table 3 Application of different mass-based biosensors in detection of Staphylococcus aureus

2.3.1 压电生物传感器

PZ效应是指晶体在电场作用下会随电信号以特定频率振动，振动的频率取决于晶体的质量以及施加在晶体上的电频率。20世纪50年代PZ效应被引入传感技术应用领域，其中石英微天平传感器是常见的PZ型生物传感器。石英晶体微天平具有非常高的灵敏度，其基本工作原理是在晶体表面涂上一种特异性结合物质，例如靶标菌的抗体，然后将其放入含有靶标菌的待测溶液中；抗原（靶标菌）与晶体表面的抗体发生特异性结合，导致晶体质量增加，共振频率相应减小，根据沉积质量与共振频率响应之间的线性关系可对靶标菌进行痕量分析。目前，这种PZ生物传感技术主要处于实验室研究阶段，还未在实际中得到应用。He Fengjiao等[72]通过联合使用叉指电极和石英晶体，建立了一种PZ生物传感器可用于铜绿假单胞菌的检测，该方法在101～106CFU/mL范围内具有良好的线性关系，检测限为10 CFU/mL，同时还被成功用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检测。Lian Yan等[73]以金黄色葡萄球菌适配体作为生物识别元件开发了一种新型适配体/石墨烯叉指金电极PZ生物传感器，用于快速、特异性地检测金黄色葡萄球菌。该方法采用分子交联剂将石墨烯键合到与石英晶体串联的叉指金电极表面，并将金黄色葡萄球菌适配体固定在石墨烯上。由于金黄色葡萄球菌和适配体的特异性结合，使得适配体从石墨烯表面解离出来，从而引起电极表面的电参数发生变化，进而导致石英晶体的共振频率发生变化，通过频率变化与细菌浓度之间的线性关系检测样品中的金黄色葡萄球菌。该生物传感器的检测限为41 CFU/mL，在4.1×101～4.1×105CFU/mL范围内表现出良好的线性关系。

2.3.2 磁弹性生物传感器

近年来，ME无标记型生物传感器在传感领域备受关注，其主要采用磁致伸缩材料带作为传感元件，具有成本低、使用方便、灵敏度高、无线传感等优点。磁致伸缩材料受到外加交变磁场的作用会沿磁场方向伸长或收缩，从而将磁能转化为机械振动，通过感应线圈可以从远处无线检测到这种机械振动[25]。ME生物传感器本身是磁致伸缩的，对ME材料的质量变化非常敏感，其基本工作原理是目标分析物与固定在带状ME传感器表面上的生物受体会发生特异性结合，从而引起传感器的质量负载发生变化，进而相应地引起传感器共振频率的变化，通过测定共振频率变化可以对目标分析物进行快速而准确地测量。Hiremath等[74]利用裂解噬菌体作为生物识别元件开发了一种ME生物传感器用于检测MRSA，检测限为103CFU/mL。Byeon等[75]在另一篇报道中同样采用裂解噬菌体作为生物识别元件建立了ME生物传感器用于现场检测菠菜叶片中的MRSA，该方法检测限为1.76×102CFU/mL。Rahman等[78]建立了基于金黄色葡萄球菌适配体结合的ME生物传感器来检测样品中的金黄色葡萄球菌，该传感器具有良好的选择性和灵敏度，检测限低至5 CFU/mL。

3 结 语

近年来，由金黄色葡萄球菌及其毒素引起的食源性疾病越来越多，特别是随着MRSA的出现，人们对金黄色葡萄球菌的检测更加关注。传统的金黄色葡萄球菌检测的方法，如培养法、免疫学方法、核酸分析法等均具有一定局限性。而基于免疫学的生物传感器技术由于快速、灵敏、操作简便等优势逐渐发展起来。本文系统阐述了基于电化学、光学和质量学分析的应用于金黄色葡萄球菌检测的生物传感器的最新研究进展。电化学生物传感器具有强大的理论背景支撑，响应速度快、成本相对较低，还具有微型化、便携式以及可再生等方面的研发潜力，在金黄色葡萄球菌生物传感器应用领域处于领先地位并持续迅速发展。光学生物传感器充分发挥了光纤和集成光学传感器的优势，可实现对金黄色葡萄球菌的可视化、无标签、实时检测分析。而质量学生物传感器与电化学和光学生物传感器相比，目前在金黄色葡萄球菌检测上的应用还很少，但鉴于其无标记、成本低且相对容易操作等特点，在未来生物传感器研发和应用领域仍有很大潜力。尽管不同类型的生物传感器各有优势，同时对其应用使得检测特异性、灵敏度和抗外界干扰能力大大提高，检测时间进一步缩短。然而，目前所研发的传感器仍然存在一些问题亟待改进：无法满足对多种金黄色葡萄球菌的同时检测；传感器的生物识别元件以抗体为主，稳定性差、容易失活且制备周期长；非特异性吸附会影响检测结果的准确性；只有少数实现了区分活细胞和死细胞的功能；样品基质（pH值、温度、离子黏度和强度等）对生物传感器的应用产生较大的影响等。因此，在设计生物传感器时，采用诸如适配体、分子印迹聚合物、纳米材料、噬菌体等新型生物识别元件，能明显改善生物识别元件的易变性及选择特异性；运用免疫磁珠等分离技术可有效去除样品基质干扰，富集靶标菌，对提高传感器的适用性具有重大意义；与纳米技术或其他学科的融合，有望进一步降低检测成本和时间，大大提高生物传感器的灵敏度、稳定性，并实现同时检测包括金黄色葡萄球菌在内的多种食源性病原体。