环状RNA在肝细胞癌发生发展中的作用研究进展

郝芬林，李涛，姚宏，查勇

（昆明医科大学第三附属医院1.肝胆胰外科2.肿瘤生物治疗中心，云南昆明650100）

大多数癌症患者在诊断时已有不同程度的转移，尽管现有针对各类癌症的治疗方法，但许多类型的癌症仍然是导致高人口病死率和高医疗支出的重要因素[1]。 肝细胞癌 （hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌的最主要的病理表现形式之一[2]，是世界上最常见的恶性肿瘤之一[3]，已成为一个严重的公共卫生问题[4]。迄今为止，常见治疗策略包括化疗、放射治疗、手术切除、靶向治疗和肝移植[5-6]。但是部分HCC 患者症状出现较晚，早期诊断较为困难，目前只有约1/3 的HCC患者能够接受根治性切除，而这些HCC 患者转移率和复发率高，预后差[7]。靶向治疗对改善晚期HCC 患者预后的效果显著，其中索拉菲尼和仑伐替尼是改善进展期HCC 患者生存期的一线用药[8]。另外传统的血液生物标志物广泛用于肿瘤诊断，但其低敏感度和特异度限制了其在普通人群肿瘤筛查中的广泛应用。面对这些挑战需要寻找潜在的生物标志物进行早期诊断和预后监测，并寻找新的靶点制定更有效的治疗策略[9]。

环状RNA（circRNA）是一类新的内源性功能性非编码RNA（non-coding RNA），在肿瘤的发生发展中起着重要作用[10]，单个的circRNA 被证明可以作为癌基因或者抑癌基因[11-12]。近来研究发现，一些circRNA 上有微小RNA（microRNA，miRNA）结合位点，作为一种新发现的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），通常存在于各种生物体中，充当“miRNA 海绵”，竞争性吸附结合miRNA，调控靶基因的表达，进而调节HCC的 进 展[13]。RNA 结合蛋白（RNA binding protein，RBP）是一类广泛参与基因转录和翻译的蛋白质，单个circRNA 包含RBP 结合基序，可能具有海绵吸附结合这些RBP 的功能,与RBP 的相互作用被认为是circRNA 功能的重要组成部分，并且通过调控RBP 的功能来间接调控HCC 的发生和发展[14]。这提示circRNA 可能作为HCC 的诊断生物标志物和治疗靶点的潜在价值[15]。本文综述了近年来circRNA 在HCC 表达失调、作用功能以及临床意义方面的研究进展。

1 circRNA概述

环状RNA 首次进入大家的视线是在1976年由Sanger 等[16]在高等植物类病毒中发现的共价闭合的环状分子形式，最初一直被认为是拼接错误的产物，后来在1979年也被发现是真核生物的内源性RNA 剪接产物[17]。随着RNA 的高通量测序技术、circRNA 特异性基因芯片分析以及生物信息学的不断发展，circRNA 的研究越来越受到关注[18]。尤其circRNA 具有很强的诊断、预后和预测的生物标志物潜力，强调其在对样本，如血浆、唾液和尿液中液体活检的检测能力[19]。

1.1 circRNA的来源和特征

与线性RNA 不同，circRNA 来源于前体mRNA（pre-mRNA）的反向剪接，是一种具有环状共价闭合结构的内源性非编码RNA[20]，可能出现在任何基因组区域，包括基因携带区域和基因间区域，长度范围从几百个到几千个核苷酸不等。大多数环状RNA 的半衰期比相应的线性RNA 的半衰期长。环状RNA 没有3'帽子端或5'尾端，这使它们比来自细胞中相同基因的典型线性转录物更稳定和丰富，对核酸外切酶具有更高的耐受性，广泛存在于真核生物中[21-22]。因其具有结构稳定、高度保守和组织特异性表达的特点，circRNA 可能在多种肿瘤中作为重要的生物标志物，其中包括HCC。21 世纪，随着RNA 测序（RNA-seq）技术和生物信息学的发展，circRNA 的丰富度和多样性得到了证实，揭示了circRNA 在不同发育阶段和生理条件下的动态表达模式[23]。大多数circRNA 在组织发育过程中表现出明显细胞类型特异性、发育阶段特异性和疾病特异性，表明它们广泛参与各种生理和病理生理过程。circRNA 的丰富度表现在，哺乳动物细胞中存在大量的circRNA，其中一些circRNA 含量丰富且稳定，表明它们可能在细胞中具有调节功能[24]。除了分布于组织，circRNA 也存在于不同的体液中，如唾液、血液、尿液和脑脊液中[25]。目前，新兴的研究正在开发通过液体活检这一微创技术在人体的各类体液中获得新型的、高度精确的生物标志物。circRNA 表达模式在肿瘤患者和健康对照组之间表现出明显的差异，这表明体液中的circRNA 可能是监测肿瘤发生和进展的新型生物标志物[26]。

1.2 circRNA的种类

circRNA 的种类包括以下3 种[7]：EcircRNA，外显子来源的circRNA，仅由外显子组成，在circRNA中占大多数，定位于细胞质中，主要通过与miRNA 或RBP 结合而发挥作用；ciRNA，内含子来源的circRNA，仅由内含子组成，分布于细胞核中；EIciRNA 是保留内含子的外显子circRNA，主要由外显子形成，但在结构中保留一小段内含子，存在于细胞核中[27]，后两者比EcircRNA 具有更少的miRNA 结合位点[28]。

1.3 circRNA的作用机制

研究[29]表明circRNA 在体内广泛表达，并且通过各种机制参与调节人体多种生命活动。circRNA可能的作用模式包括充当“miRNA 海绵”、与蛋白质的相互作用以及调节蛋白质翻译过程。

1.3.1 与miRNA 结合 circRNA 在癌症中最著名的功能是充当“miRNA 海绵”并竞争miRNA 上的mRNA 结合位点，间接调控miRNA 靶基因的表达，从而调节肿瘤的进展，即circRNA 的“miRNA 海绵”功能模型。最早提出这一功能模型的是Max Delbruck 柏林医学系统生物学研究所的Rajewsky 团队[30]，其发现CDR1as 上存在多达63 个miR-7 的结合位点，由此提出“miRNA 海绵”这一功能模型，也称为最著名的circRNA 功能模型。近来发现，CDR1as 可通过miR-7 介导的机制调节肿瘤的转移。此外，CDR1as 水平反映了与不同治疗反应相关的细胞状态[31]。circRNA 能够通过作为竞争性内源RNA 调节基因表达，也被称为“miRNA 海绵”，在许多生物学过程中吸附结合来调节miRNA 靶向mRNA 的表达[32]。circRNA 与疾病相关miRNA 的 相互作用表明circRNA 在包括癌症在内的多种疾病中起重要调控作用。一个特异的circRNA 可能与多个miRNA 结合，而不同的circRNA 可能与一个特异的miRNA 相互作用，表明circRNA 可能通过调节不同的miRNA 而影响HCC 的进展。另外，许多circRNA被认为在神经发育和上皮-间质转化过程中起作用[33]。circRNA 通过其调节功能在肿瘤的发生发展过程中起癌基因或抑癌基因的作用，这表明circRNA 可能是肿瘤诊断的新的生物标志物或治疗靶 点。Wang 等[9]发 现hsa_circ_0091570 在HCC 组 织和细胞系中的表达水平明显下调，其下调可促进HCC 细胞增殖和迁移，抑制HCC 细胞凋亡，从而促进肿瘤的生长。RNA 体内沉淀实验测定HCC 细胞中可能与hsa_circ_0091570 相互作用的miRNA，得出hsa_circ_0091570 可以作为miR-1307 的“海绵”，进而调节ISM1 的表达，即hsa_circ_0091570 通过保护ISM1 免受miR-1307 的下调而发挥抗肿瘤作用。circRNA 在肿瘤发生发展中作为“miRNA 海绵”发挥功能不仅见于HCC，也见于其他类型的癌症，例如乳腺癌、结直肠癌。Liu 等[34]发现hsa_circ_001783 在乳腺癌组织中的表达明显高于配对的非癌组织，Kaplan-Meier 分析进一步显示hsa_circ_001783 表达水平较高的患者更容易发生复发，且无病生存率低。多因素分析显示hsa_circ_001783 的表达水平是预测乳腺癌患者预后的独立因素。而且hsa_circ_001783 通过吸附结合miR_200c_3p 促进乳腺癌细胞的进展，可以作为乳腺癌新的预后标志物和治疗靶点。Hu 等[35]发现结直肠癌组织和细胞中circFAT1、UHRF1 水平升高，miR-520b、miR-302c-3p 水平降低。敲低circFAT1 可抑制细胞增殖、周期、糖酵解以及诱导细胞凋亡。circFAT1 是miR-520b 和miR-302c-3p 的“海绵”，而miR-520b 和miR-302c-3p 可以靶向UHRF1。 提示circFAT1 上 调UHRF1，通过靶向miR-520b 和miR-302c-3p 影响结直肠癌细胞增殖、凋亡和糖酵解，为结直肠癌的治疗提供理论依据。作为“miRNA 海绵”的circRNA 为诊断和治疗多种类型的肿瘤提供了新的方向，肿瘤发生发展中的circRNA-miRNA 基因调控网络有待进一步的研究。

1.3.2 与RBP 结合 RBP 在转录后修饰和mRNA 翻译中起着至关重要的作用。circRNA 以ceRNA 机制来调节RBP 的功能，此外circRNA 作为“RBP 海绵”调节下游基因转录，即作为载体将RBP 储存、分类或传递到特定的亚细胞位置[36]。Zhu 等[37]发现circZKSCAN1 通过调节RBP 脆性X 智力低下蛋白（FMRP）的功能，阻断FMRP 与β-catenin 结合蛋白细胞周期和凋亡调节因子1（CCAR1）mRNA 的结合，从而使Wnt/β-catenin 信号通路失活。此外，circZKSCAN1 在体内诱导肿瘤静止，表明其具有精确靶向治疗的潜力。这揭示了circZKSCAN1 在抑制HCC 细胞的干细胞（HCC-CSCs）调节作用的机制，并确定了新发现的circZKSCAN1-FMRP-CCAR1-Wnt 信号轴可能是HCC治疗的重要靶点。

1.3.3 翻译成蛋白 circRNA 可翻译成有功能性蛋白，此类研究比较新颖。Bozzoni 团队[38]发现circ-ZNF609 与重链多核糖体相关，并以剪接依赖性和帽依赖性的方式翻译成蛋白质，从而提供了真核生物中编码蛋白质circRNA 的一个例子。Yang 等[39]发现circ-FBXW7 在正常人脑中大量表达，由内部核糖体进入位点驱动的circ-FBXW7 跨接开放阅读框编码了一种新的21 kDa 蛋白，将其称为FBXW7-185aa。癌细胞中FBXW7-185aa 的上调抑制了增殖和细胞周期的加速，而FBXW7-185aa 的敲低则促进了体内和体外的恶性表型。此外，胶质母细胞瘤临床样本中的circ-FBXW7 和FBXW7-185aa 水平与其配对的肿瘤相邻组织相比表达降低（P＜0.001）。circ-FBXW7 表达与胶质母细胞瘤患者的总体生存呈正相关（P=0.03）。说明内源性circRNA 可编码细胞中的有功能性的蛋白，且circ-FBXW7 和FBXW7-185aa 对脑胶质母细胞瘤具有潜在的预后影响。

2 circRNA在HCC中的作用

circRNA 主要通过circRNA-miRNA-mRNA 轴 调控癌基因或抑癌基因的表达。大量的circRNA 在HCC 组织中异常表达，提示这些circRNA 可能在HCC 的发生、发展过程中发挥重要作用，其中主要包括生长、凋亡、转移、侵袭、细胞周期、上皮间充质转化和信号通路等方面。

2.1 circRNA在HCC中的抑癌作用

越来越多的研究表明circRNA 可作为抑癌因子负性调控HCC 细胞增殖、分化、迁移、侵袭等生物学进程，抑制HCC 的发生发展。一般来说，上调的circRNA 在HCC 中作为癌基因发挥促癌作用，促进细胞生长增殖、迁移和侵袭，但抑制细胞周期阻滞和凋亡（表1）。

表1 circRNA在HCC中的生物学功能及作用机制Table 1 Biological function and action mechanism of circRNAs in HCC

Qin 等[40]发现hsa_circ_0001649 在HCC 组织中的表达明显低于其在配对癌旁组织中的表达，且其表达水平与肿瘤生长呈反相关， 即hsa_circ_0001649 可能发挥抑癌作用。对hsa_circ_0001649 的序列进行研究发现其多个潜在的RBP 结合位点，提示hsa_circ_0001649 可能与蛋白质吸附结合或作为一种转录调节因子参与HCC 的发生和发展。Han 等[41]分析了circRNA 在HCC 组织中的表达谱，发现circMTO1 是一种肿瘤相关分子在HCC 组织中表达明显下调，且HCC 组织中circMTO1 的表达降低与HCC 患者的预后不良显著相关：与高表达者相比，低表达的HCC 患者生存期缩短，所以HCC组织中circMTO1 的降低可能作为预后不良的预测指标。circMTO1 吸附结合致癌基因miR-9，通过circMTO1/miR-9/p21 轴抑制HCC 的进展，提示其在HCC 发生发展中的抑癌作用。此外，circMTO1 的体内干预显示了其在HCC 靶向治疗中的潜力，提示circMTO1 可作为HCC 潜在的治疗靶点和预后生物标志物。Yu 等[42]发现cSMARCA5 在HCC 组织中的表达水平较低，cSMARCA5 的下调与HCC 的侵袭性特征显著相关，是HCC 患者术后总生存率（OS）和无复发生存率（RFS） 的独立危险因素。cSMARCA5通过诱导miR-17-3p 和miR-181b-5p 促 进其共同靶点肿瘤抑制因子TIMP3 的表达，从而抑制HCC 细胞的增殖和迁移。Chen 等[43]发现hsa_circ_0051443 是经外泌体从正常细胞向HCC 细胞转移，通过促进细胞凋亡和阻断细胞周期抑制肿瘤恶性生物学行为。HCC 患者的组织和血浆外泌体中的hsa_circ_0051443 表达明显下调。hsa_circ_0051443 高表达可抑制体内肿瘤生长，并通过激活miR-331-3p来调控其靶基因BAK1，从而促进HCC 细胞凋亡，发挥抑癌作用。Chen 等[44]发现circ_0003418 在HCC组织和细胞系中表达下调，且与HCC 患者肿瘤大小、TNM 分期及HBsAg 水平相关。circ_0003418 可通过抑制Wnt/β-catenin 途径抑制HCC 细胞的增殖、迁移和侵袭，并提高HCC 细胞对顺铂的敏感度从而起到抑癌作用。circ_0003418 敲低可激活HCC 细胞中的Wnt/β-catenin 信号通路，促进HCC 细胞的增殖、迁移和侵袭。因此，circ_0003418 可能是一种新的生物标志物，并提供了治疗HCC 的新思路。Li 等[45]发现circ-102，166 在HCC 中表达降低，其表达水平与多种临床病理特征及HCC 患者的临床预后显著相关。体外和体内实验表明，circ-102，166过表达显著抑制HCC 细胞的增殖、侵袭、迁移和致瘤性。此外，circ-102，166 可以与miR-182 和miR-184 结合，调节其下游几个靶点（FOXO3a、MTSS1、SOX7、p-RB 和c-MYC）的表达，表明circ-102，166 在HCC 中具有肿瘤抑制作用。

2.2 circRNA在HCC中的促癌作用

除了作为肿瘤抑制因子外，一些circRNA 可通过靶向肿瘤抑制基因影响肿瘤的发生发展，已经被证实在包括HCC 在内的多种人类癌症中对肿瘤细胞增殖、转移、侵袭具有重要的调控作用。一般来说circRNA 下调的典型功能是作为HCC 中的抑制因子,抑制细胞增殖、转移和侵袭，同时诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。

Wang 等[46]发现在HCC 组织中，circRHOT1 是1 个表达明显上调的circRNA，高表达circRHOT1 的HCC 患者多预后不良。通过体外和体内实验，证明circRHOT1 能显著促进HCC 的生长和转移。在机制上，circRHOT1 通过依赖于TIP60 的NR2F6 表达促进HCC 的进展，circRHOT1 可能是HCC 预后的潜在生物标志物。Cao 等[47]通过基因表达结合数据分析筛选HCC 组织中差异表达的circRNA 及应用qRTPCR 检测，发现在HCC 细胞系中hsa_circ_101280 高表达而其下游miR-375 低表达，体外研究显示hsa_circ_101280 通过上调miR-375 和JAK2，促 进HCC 细胞的增殖并且抑制其凋亡，从而极大地促进了HCC 的发生发展。Zhan 等[48]发现has_circ_103809 在HCC患者中高表达，hsa_circ_103809 基 因敲低显著抑制HCC 细胞增殖和迁移，表明hsa_circ_103809 通过调节miR-377-3p/FGFR1/ERK 轴促进HCC的发生和发展。Hu 等[49]通过体内体外研究表明circASAP1 促进HCC 生长和肺转移，促进细胞增殖、集落形成、迁移侵袭。circASAP1 作为miR-326 和miR-532-5p的竞争性内源性RNA （ceRNA），而MAPK1 和CSF-1 是miR-326 和miR-532-5p 的直接共同靶点， circASAP1 作用于miR-326/miR-532-5p-MAPK1/CSF-1 信号通路促进HCC 细胞增殖和侵袭，并且可能预测HCC 患者预后。Yang 等[50]发现hsa_circ_0039053 在HCC 组织和细胞系中高表达，其高表达与晚期HCC 患者的临床特征相关。下调hsa_circ_0039053 的表达会抑制HCC 增殖和侵袭能力。hsa_circ_0039053 作为一种ceRNA 通过结合miR-637 正向调控USP21 表达，从而起到抑癌作用。Yu 等[51]发现circMAST1 在HCC 组织和细胞系中上调，通过siRNA 沉默circMAST1 的表达可以抑制HCC 细胞的迁移、侵袭和增殖以及在体内的肿瘤生长。在HCC 临床样本中，circMAST1D 的表达与catenin delta-1 （CTNND1） 呈正相关，与miR-1299呈负相关。circMAST1 通过结合miR-1299 和稳定CTNND1 的表达促进HCC 进展。因此circMAST1 可能作为HCC 的新型生物标志物和治疗靶点。Huang等[52]发现hsa_circRNA_104348 在HCC 组织和细胞中明显上调，且hsa_circRNA_104348 高表达的HCC 患者预后较差。hsa_circRNA_104348 促进HCC 细胞增殖、迁移和侵袭，同时抑制HCC 细胞凋亡。此外，hsa_circRNA_104348 直接靶向miR-187-3p，可调节miR-187-3p 影响HCC 细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡，并可能对Wnt/β-catenin 信号通路产生影响。RTKN2 可能是miR-187-3p 的直接靶点。 hsa_circRNA_104348 可能 通 过靶 向miR-187-3p/RTKN2 轴和激活Wnt/β-catenin 通路，作为竞争性内源性RNA（ceRNA） 促 进HCC 进 展。Zhang 等[53]研究发现circPUM1 在HCC 细胞呈高表达。在体外能促进HCC 细胞增殖、迁移和侵袭；体内研究表明，circPUM1 可增加HCC 肿瘤的发生，并调节EMT 相关蛋白的表达。此外，circPUM1 可以通过结合miR-1208 从而上调MAP3K2 的表达来促进HCC 的发展，证明circPUM1 可能是HCC 的潜在治疗靶点。

3 circRNA与HBV相关性HCC

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV） 和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是HCC 的主要病因。慢性乙型肝炎病毒感染是亚洲和撒哈拉以南非洲大多数地区HCC 高发的主要危险因素[54]。慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB） 在全球范围内影响着20 多亿人，尤其是亚太地区，每年约有65 万例死亡[55]。慢性乙型肝炎病毒感染可导致严重的肝脏疾病，包括纤维化、肝硬化和HCC，并对其他多个器官产生影响[56]。大多数HCC 患者有HBV 感染，继发于慢性坏死性炎症[57]。circRNA在慢性乙型肝炎肝组织中的表达与正常肝组织不同，与对照组织相比，CHB 组织中有一系列circRNA 差异表达，如与正常组织相比，CHB 中有1 个circRNA （hsa_circ_0000650） 下 调。Hsa_circ_0000650 与TGFB2 呈正相关（P=0.01），与miR-6873-3p呈负相关（P＜0.05），提 示hsa_circ_0000650 与miR-6873-3p 介导的TGFB2 相互作用。差异最大的circRNA 代表了对CHB 有潜在价值的诊断生物标志物。circRNA 可以与CHB 中的miRNA 相互作用，这种相互作用有望成为HBV 感染和CHB 进展的新机制[58]。到目前为止，至少有4 个circRNA/miRNA 调控轴，如circRNA_101764/miR-181、circRNA_100338/miR-141-3p、 circ-ARL3/miR-1305、 circ-ATP5H/miR-138-5p 和几种循环circRNA 被报道与HBV-HCC 的发展相关[59]。

Huang 等[60]发现circRNA_100338 是HCC 中上调的circRNA 之一，其高表达与乙型肝炎HCC 患者的低累积生存率和转移进展密切相关。circRNA_100338 在HCC 中充当miR-141-3p 的内源性“海绵”，circRNA_100338 和miR-141-3p 在HCC 细胞侵袭潜能调节中起拮抗作用。在乙型肝炎相关的HCC 患者中，HCC 组织中多个circRNA 的差异表达及其临床意义表明，circRNA_100338 是一个潜在的有价值的HCC 诊断生物标志物和治疗靶点。Wu等[61]发现与慢性肝炎或健康对照组相比，circ_0009582，circ_0037120 和circ_0140117 在HBV 相 关的HCC 样本中表达升高，可能作为预测HBV 感染患者HCC 发生的潜在生物标志物。

4 小 结

综上，肿瘤的发生和发展也是一个动态复杂的过程，HCC 是全球第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因，且晚期HCC 患者生存率较低，一直是人类共同面临的严重健康问题，虽然近年来相继开展了新的治疗方法，但HCC 的生存率仍然很低，预后很差。液体活检等新型的微创方法，在肿瘤早期检测中特异性较高，敏感性较低，可以监测肿瘤进展、转移和复发。因HCC高度异质性的特征，HCC 患者对治疗方案表现出不同的敏感性。在液体活检中，基因组特征个体变异的识别有潜力极大地提高精准肿瘤学能力，从而推进HCC 的个性化治疗。上述阐明环状RNA作为“miRNA 海绵”和“RBP 海绵”发挥吸附结合作用的重要功能，HCC 中差异性circRNA 的表达谱及其生物学功能的变化，在HCC 的高危群体筛查、早期诊断、早期治疗、预后评估和术后肿瘤复发等方面具有重要的临床应用价值。现阶段对环状RNA 的研究主要集中在其生物发生、环化方式及作为ceRNA 的机制等几个方面，进一步的研究需要解决circRNA 的准确检测、验证、功能分析及其统一命名等，使人们更广泛地了解在HCC 中特异性表达的circRNA 谱，包括其性质、功能和作用机制在HCC 中的深入研究，这将丰富对HCC 发生过程中复杂调控网络的认识，有助于为circRNA 在HCC 早期诊断干预提供新的思路和理论依据，减轻HCC 所带来的经济负担和社会压力。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。