外周血CKLF1、CCR4与高血压脑出血后血脑屏障破坏及预后的关系

于大君，董春玉，于永鹏

脑出血为神经外科常见疾病，是指非外伤性脑实质内血管破裂而引起的出血，具有发病急、致残率与致死率高、预后差的特点，高血压脑出血属于高血压严重的并发症，多发于中老年人，且发病率有升高趋势[1-2]。因此，寻找反映脑出血病人病情严重程度和预后的标志物对于其预防和治疗具有重要意义。脑出血引起的脑损伤是一个复杂的过程，研究表明，一些细胞因子和炎症反应在脑损伤中发挥重要作用，趋化素样因子1(chemokine-like factor 1，CKLF1)属于趋化素样超家族，具有趋化因子的结构特征和功能，在炎症性疾病中发挥一定作用[3]。罗泽兵等[4]研究表明，重症颅脑损伤术后脑梗死病人血清CKLF1水平升高，且随着病情加重，血清CKLF1水平升高，并与病人预后有关。趋化因子受体(chemokine receptor，CR)属G蛋白偶联受体，CC趋化因子受体4(CCR4)为CC趋化因子受体(CCR)的一种，能促进白细胞浸润及细胞增殖，也是CKLF1的受体[5]。研究表明，在脑缺血损伤模型中，香豆素类衍生物IMM-H004可下调CKLF1与CCR4表达，抑制NOD样受体家族3(nucleotide binding oligomerization domain，NLRP3)炎症小体激活及相关炎症反应，改善脑缺血程度[6]。目前CKLF1、CCR4在高血压脑出血病人中的研究报道不多。本研究通过检测高血压脑出血病人外周血CKLF1、CCR4表达情况，并探讨其与脑出血后血脑屏障破坏的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年5月—2020年6月就诊的高血压脑出血病人85例作为脑出血组，其中，男55例，女30例；年龄42～74(58.30±8.70)岁。纳入标准：①符合2015年脑出血的诊断标准[7]，并经CT或磁共振成像(MRI)诊断为脑出血；②发病至入院时间<12 h；③有高血压病史；④病人或家属知情同意。排除标准：①颅内动脉瘤破裂出血、肿瘤、创伤等其他因素引起的脑出血；②既往有血液系统疾病，如血小板计数减少、弥漫性血管内凝血等；③严重脑、心、肝、肾等脏器器质性病变或功能障碍者；④临床资料不全者。病人入院后进行开颅血肿清除术，术后给予止血、降低颅内压、预防感染等常规治疗，术后2周根据格拉斯哥预后量表(GOS)评分将病人分为预后良好组(GOS评分4分或5分，54例)和预后不良组(GOS评分1～3分，31例)。另选取同期健康体检者85名作为对照组，其中，男60名，女25名；年龄41～73(57.90±8.40)岁。脑出血组与对照组性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，病人或家属签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 白蛋白检测试剂盒购于美国 Sigma 公司，CKLF1、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)、血清 S100钙结合蛋白B(S100B)检测试剂盒购自美国R & D公司，荧光标记的小鼠抗人FITC-CD4、PE-CCR4及FITC-IgG1、PE-IgG1抗体购自美国R&D公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及保存 采集脑出血病人与健康体检者清晨空腹静脉血各5 mL，取其中一部分，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)，用于检测CCR4。其余在室温条件下静置30 min，常温下1 500 r/min离心20 min后收集血清，于-80 ℃条件保存备用，用于CKLF1及其他生化指标检测。

1.3.2 流式细胞仪检测外周血CCR4水平 取分离的PBMCs，加细胞悬液100 μL至检测管，加入FITC-CD4单克隆抗体及设置同型对照管和检测管，室温避光孵育30 min，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤后加入破膜液100 μL，同时加入鼠抗人PE-CCR4单克隆抗体及小鼠FITC-IgG1、PE-IgG1抗体，避光温育30 min，PBS洗涤2次后，加入多聚甲醛溶液上流式细胞仪检测，以CD4+CCR4+百分数表示CCR4水平。

1.3.3 其他指标检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测CKLF1、CRP、IL-6、TNF-α、S100B及白蛋白水平，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 资料收集 收集研究对象的年龄、性别、舒张压、收缩压、美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分等临床资料，并计算血脑屏障功能指数(blood-brain barrier，BBB指数)，BBB指数=脑脊液白蛋白/血清白蛋白。

2 结 果

2.1 脑出血组与对照组临床资料比较 与对照组比较，脑出血组舒张压、收缩压、CRP、TNF-α、IL-6、S100B水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 脑出血组与对照组临床资料比较

2.2 脑出血组与对照组外周血CKLF1、CCR4水平比较 与对照组比较，脑出血组外周血CKLF1、CCR4水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 脑出血组与对照组外周血CKLF1、CCR4水平比较 (±s)

2.3 高血压脑出血病人外周血CKLF1、CCR4水平与BBB指数、NIHSS评分的相关性 相关性分析显示，高血压脑出血病人外周血CKLF1水平与BBB指数、NIHSS评分呈正相关(r值分别为0.576，0.542；P均<0.05)，CCR4水平与BBB指数、NIHSS评分呈正相关(r值分别为0.543，0.519；P均<0.05)。详见图1。

图1 CKLF1、CCR4水平与BBB指数、NIHSS评分的相关性(A为CKLF1与BBB指数的相关性；B为CKLF1与NIHSS评分的相关性；C为CCR4与BBB指数的相关性；D为CCR4与NIHSS评分的相关性)

2.4 不同预后高血压脑出血病人外周血CKLF1、CCR4水平比较 与预后良好组比较，预后不良组外周血CKLF1、CCR4水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 不同预后高血压脑出血病人外周血CKLF1、CCR4水平比较 (±s)

2.5 高血压脑出血病人预后不良的影响因素 以脑出血病人预后不良为因变量，将CKLF1、CCR4水平作为自变量，Logistic回归分析结果显示，CKLF1、CCR4水平均是影响高血压脑出血病人预后不良的独立危险因素(P<0.05)。详见表4。

表4 高血压脑出血病人预后不良的影响因素

3 讨 论

高血压脑出血是高血压最严重的并发症之一，病人以头痛剧烈、恶心呕吐、肢体麻木等为主要临床表现，伴有躁动、嗜睡或昏迷等症状，严重者可导致颅内压升高、呼吸衰竭、脑疝等，该病起病急、预后差，因此，早期诊断疾病、评估病情对改善预后具有重要意义[8-9]。

趋化因子能调节和控制细胞向炎症组织的定向迁移、诱导细胞分化，CKLF1是一种人类趋化因子，是CCR4的功能性配体，对单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞具有趋化作用，参与多种炎症和自身免疫性疾病的病理过程[10]。研究表明，局灶性脑缺血后CKLF1表达升高，抑制CKLF1活性可减轻中性粒细胞浸润和神经元凋亡，对脑缺血具有神经保护作用，CKLF1还可参与再灌注后血脑屏障的破坏，抑制CKLF1可以维持血脑屏障的完整性，从而避免脑缺血症状[11]。Tao等[12]研究表明，风湿性关节炎和强直性脊柱炎病人滑膜中CKLF1水平明显升高，且风湿性关节炎病人CKLF1水平与炎性因子水平呈正相关。本研究结果显示，脑出血组外周血CKLF1水平较对照组明显升高，提示脑出血病人存在炎症反应。预后不良组外周血CKLF1水平较预后良好组明显升高，提示CKLF1可能参与脑出血发生，与脑出血病人预后有关。

趋化因子受体属G蛋白偶联受体，CCR4为CCR的一种，能促进白细胞浸润及细胞增生。Chen等[13]研究表明，缺血性脑卒中小鼠模型中，经CKLF1给药后，CKLF1通过CCR4加重早期局灶性脑缺血损伤，并促进小胶质细胞/巨噬细胞向M1表型极化，并且脑缺血小鼠的促炎细胞因子表达升高，抗炎细胞因子表达降低。孙立华等[14]研究表明，慢性乙型肝炎病人外周血中辅助性T细胞17(Th17)表面CCR4水平明显升高，且随着病情加重，CCR4水平升高。本研究结果显示，与对照组相比，脑出血组外周血中CCR4水平明显升高，且预后不良组外周血CCR4水平高于预后良好组，提示外周血CCR4水平可能与脑出血病人疾病发展及预后有关。

有研究认为，脑出血可以导致神经细胞功能障碍、血脑屏障破坏等，从而引起大量炎性因子、细胞因子释放，多种因子相互作用，进而加重脑损伤。CRP和TNF-α为常见的血清炎性因子，脑出血时血清CRP和TNF-α水平升高，TNF-α可进一步诱导IL-6等促炎因子合成和释放，增强炎症细胞的黏附作用，提高血脑屏障通透性[15]。S100B反映脑损伤的严重程度，对脑出血病人病情评估有一定价值[16]。本研究结果显示，脑出血组血清CRP、TNF-α、IL-6、S100B水平较对照组升高，说明高血压脑出血病人体内存在炎症反应和脑损伤，而CKLF1、CCR4升高可与炎症反应有关。相关性分析显示，CKLF1、CCR4水平与BBB指数和NIHSS评分呈正相关，提示CKLF1、CCR4与脑出血病人血脑屏障破坏和神经损伤有关。进一步分析显示，CKLF1、CCR4水平高是影响高血压脑出血病人预后不良的独立危险因素，提示CKLF1、CCR4可作为脑出血病人预后评估的标志物。

综上所述，高血压脑出血病人外周血中CKLF、CCR4高表达，且与脑出血病人血脑屏障破坏和预后相关，有可能作为脑出血后病情评估与预后评估的标志物，但其具体作用机制仍需进一步研究。