复合促生菌剂发酵条件优化及其对青稞促生效果评价

杨晓蕾, 李建宏*, 姚 拓, 陈建纲, 李 琦, 张建贵, 王国基

(1.甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室， 甘肃 兰州 730070； 2.兰州苗乐农业科技发展有限公司，甘肃 兰州 730070)

农用微生物菌剂(Microbial inoculants in agriculture)是指将有益微生物进行工业化生产扩繁后制得的一类活菌制剂[1]。其产品按微生物功能可分为根瘤菌剂、固氮菌剂、解磷菌剂、促生菌剂、硅酸盐菌剂、菌根菌剂、光合菌剂、有机物料腐熟剂和生物修复菌剂9种类型[2]。其中促生菌剂，又称根际促生菌剂(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)可以促进植物生长发育，抑制土壤病原菌生长，还能直接或间接地改良土壤，恢复土地肥力[3]，近年来已成为农学领域的研究热点[4-5]。由于不同微生物促生特性不同，使用单一菌株制成的微生物菌剂很难发挥理想的促生效果，利用两种或两种以上且互不拮抗的微生物菌种制成复合促生菌剂，功能多样，促生效果更强[6]。有关促生菌剂在饲草上的应用研究较多，但对促生菌剂发酵培养基和培养条件以及发酵菌剂对饲草生长的影响研究较少。

菌剂接种量是影响PGPR在植物根部定殖的主要影响因素之一，为确保促生菌剂发酵液质量与效果，适宜的发酵培养基及培养条件尤为重要[7]。碳源为微生物生长提供碳素营养物质[8]，发酵用碳源主要有葡萄糖、淀粉、蔗糖、甘油等[9]。氮源在微生物生长过程中常参与合成代谢物质，同时构成多种含氮有机物，还可以补充碳源[10]。无机盐物质能提高微生物生理活性，为微生物提供多种金属离子。同时，适宜的培养条件可以提高菌株繁殖速率，常见的培养条件包括初始pH、温度、接种量、发酵时间、溶氧量等因素[11]。发酵培养基初始pH影响细胞膜通透性及膜电荷状态，适宜的pH范围会使得菌体生长量提高[12]；接种量影响发酵过程溶氧量及培养基营养物质消耗，接种量过高会造成菌体生长过快[13-14]；装液量和转速影响微生物生长过程中的溶氧量，转速越高，装液量越少，发酵液中溶氧浓度越高[15]。

青稞(Hordeumvulgarevar.Nudum)即裸大麦，是我国青藏高原及西北高寒地区主要的饲草作物。本研究利用课题组前期分离自高寒草地的优良植物根际促生菌株Y1(Bacillusmycoides),Y3(Bacillussubtilis)，M1(Pseudomonassynxantha)为研究对象，构建复合促生菌剂发酵体系，在单因素试验基础上，利用响应面优化试验，优化根际促生菌剂发酵培养基，确定适宜的培养条件，通过盆栽试验评价优化后菌剂的促生效果，以期为复合促生菌剂在高寒草地的大规模施用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试菌株 供试菌株由甘肃农业大学草业学院草地微生物多样性实验室提供(表1)。菌株由实验室前期从草地植物根际分离筛选而出，具有较强的促生能力和温度耐受性。

表1 供试菌株Table 1 Strains for test

1.1.2供试培养基 种子培养基(g·L-1)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠5 g，pH=7.0，121℃灭菌30 min。

发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠5 g，pH=7.0，121℃灭菌30 min。

甘油、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米浆、豆粕、鱼粉和黄豆饼粉购自北京索莱宝科技有限公司，酵母粉和蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限公司，硫酸铵、碳酸钙、硝酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1菌剂配方及种子液培养 试验过程中所用菌剂配方均为Y1∶Y3∶M1=1∶1∶1，将活化菌液以2%接种量移种于50 mL种子培养基中，培养24 h，即得到种子培养液。

1.3.2发酵培养基组成单因素筛选 分别以1%的甘油、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉替代发酵培养基碳源；1.5%的玉米浆、豆粕、鱼粉、黄豆饼粉、酵母粉、蛋白胨替代发酵培养基氮源；0.5%的硫酸铵、碳酸钙、硝酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾+磷酸二氢钾(1∶1)替代发酵培养基无机盐[14-15]，以OD600值为评价指标，培养条件为温度31℃，初始pH=6.0，接种量2%，摇床转速180 r·min-1，装液量30 mL(每150 mL三角瓶)，培养时间48 h。

1.3.3混合菌系高密度发酵培养基优化响应面试验 根据单因素优化结果，运用Design-Expert 8.0 软件，选择甘油(A)、蛋白胨(B)、酵母粉(C)、碳酸钙(D)四个因素，各因素取3个水平(—1，0，1)，设计四因素三水平[L9(34)]正交试验，各处理3次重复，因素水平表见表2。

表2 混合菌系高密度发酵培养基优化Box-Behnken试验因素与水平Table 2 Optimization of Box-Behnken test factors and levels of mixed strains of high-density fermentation medium

1.3.4最佳培养条件的优化 以优化后的培养基为基础，分别设置初始pH(4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0)；接种量(2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%，18%，20%)；摇床转速(140，160，180，200，220，240，260 r·min-1)；装液量[(20 mL，30 mL，40 mL，50 mL，60 mL)每150 mL三角瓶][16]，培养温度31℃，培养时间48 h，测定OD600值，每处理3次重复。确定最适发酵培养基和培养条件后，参考国标GB 20287-2006《农用微生物菌剂》[1]，每个处理6次重复，对发酵条件优化后的菌剂进行活菌数计数。

1.4 复合根际促生菌剂的促生效应评价

选用颗粒饱满且大小一致的青稞种子，用1%的次氯酸钠消毒10 min后，无菌水清洗3次，种植于装有200 g花土的塑料花盆中(规格：外径11.5 cm×内径8.5 cm×高12.0 cm)，每杯种植青稞15株。以无菌水为对照组(CK)，发酵条件优化前后生产的菌液为处理，每个处理4次重复。7 d出苗后以相同接种量灌根，每盆12 mL。以第一次灌根为起始时间，待植物生长45 d后收获，测定幼苗的株高、鲜重、叶绿素及根系形态。

1.5 数据分析

采用Excel，Design-Expert软件进行数据整理和作图，SPSS 25.0进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基碳源、氮源、无机盐的确定

2.1.1碳源 碳源作为微生物生长重要营养物质，为微生物提供生长、繁殖、代谢和其他生理活动的基础能量，常为各种常见细胞代谢产物中碳骨架的主要来源。碳源优化结果见图1。综合分析结果表明，混合菌系对甘油的利用效果最好，显著高于其他碳源(P<0.05)，葡萄糖次之，可溶性淀粉最差，因此甘油为发酵培养基最佳碳源。

图1 碳源物质对复合菌系生长的影响Fig.1 Effects of carbon source material on strains growth注：不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同Note：Different letters indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.1.2氮源 氮元素是构成微生物细胞的基本元素，微生物能够利用氮源合成蛋白质、核酸、氨基酸等关键物质。氮源优化结果见图2。综合分析结果表明，混合菌系对蛋白胨+酵母粉配合的利用效果最好，豆粕粉不利于混合菌系的生长，因此复合氮源蛋白胨+酵母粉为发酵培养基最佳氮源。

图2 氮源物质对复合菌系生长的影响Fig.2 Effects of nitrogen sources material on strains growth

2.1.3无机盐 无机盐在微生物的生命活动中起到调节生物酶活、调节渗透压平衡、维持细胞膜内外物质交换、调节pH等作用。无机盐优化结果见图3。综合分析结果表明，混合菌系对碳酸钙的利用效果最好，因此选择碳酸钙为发酵培养基无机盐。

图3 无机盐对复合菌系生长的影响Fig.3 Effects of inorganic salt on strains growth

2.2 复合菌剂发酵培养基响应面优化结果

2.2.1响应面模型构建及方差分析 基于Box-Benhnken中心组合设计响应面试验，选择OD600的4个影响因素：甘油(A)、蛋白胨(B)、酵母粉(C)、碳酸钙(D)进行4因素3水平响应面分析试验，试验设计结果见表3，方差分析见表4。

表3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Design and results of Box-Behnken test

表4 响应面二次模型方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for response surface second-order polynomial equation

利用Design-Expert 10.0.3软件对数据进行分析，得到二次多项回归方程：Y=4.367+0.289A—0.001B+0.101C+0.02D—0.323AB—0.062AC—0.005AD—0.014BC—0.133BD+0.106CD—0.346A2—0.42B2—0.43C2—0.359D2。

该模型回归极显著(P<0.0001)，失拟值P=0.0589>0.05，不显著；模型的决定系数R2=0.9758，调整决定系数AdjR2=0.9515，表明该方程拟合度高，可以很好地预测混菌发酵体系的最适发酵条件。根据F值可知，4个因素对OD600影响大小顺序为：甘油(A)>酵母粉(C)>碳酸钙(D)>蛋白胨(B)。同时，一次项A,C，交互项AB，BD及二次项A2，B2，C2，D2对结果影响极显著(P<0.01)，交互项CD对结果影响显著(P<0.05)，其他项对结果影响不显著。

2.2.2最优条件参数确定及模型验证 运用Design-Expert 10.0.3软件运行优化分析，由图4各因素交互作用响应面图分析，最终确定最优提取工艺为：甘油12.920 mL·L-1、蛋白胨9.023 g·L-1、酵母粉5.042 g·L-1、碳酸钙5.093 g·L-1，在此条件下模型预测的OD600为4.443。结合实际工艺设置的可行性，取甘油13 mL·L-1、蛋白胨9 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、碳酸钙5 g·L-1为条件进行三次重复试验，平均OD600为4.328，与模型预测值偏差2.58%，表明基于该响应面模型分析优化OD600提取工艺的方法有效可行。

图4 甘油、酵母粉、碳酸钙、蛋白胨交互作用对复合菌剂OD600值的响应面图Fig.4 Response surface diagram of the interaction of glycerol,yeast extract,CaCO3,and peptone on the OD600value of microbial agents

2.3 最佳培养条件优化

2.3.1初始pH的确定 如图5-a所示，随着初始pH值的改变，菌株生长速率不断变化。pH<5.0或>9.5时，混合菌系生长缓慢；pH在6.5～7.5时，混合菌系OD600值较高，在pH=7.0时达到最大，为3.238。综上，混合菌系最适初始pH为7.0。

2.3.2接种量的确定 由图5-b可知，混合菌系在接种量为2%～10%时，随着接种量的增加，混合菌系菌体的OD600值升高；当接种量为10%时，OD600值最高，为3.037；接种量大于10%后，随着接种量的增加，菌体OD600值下降。综上，混合菌系最佳接种量为10%。

2.3.3摇床转速的确定 由图5-c可知，混合菌系发酵液OD600值随着摇床转速的增加而增大，当摇床转速为220 r·min-1时，菌体的OD600值最大，为3.711。当摇床转速大于220 r·min-1时，发酵液的OD600值趋于平缓。结合实际生产情况，确定最佳摇床转速为220 r·min-1。

2.3.4装液量的确定 由图5-d可知，在混合菌系发酵过程中，采用30 mL的装液量时，菌体OD600值最大，为3.620；随着装液量的增大，菌体OD600值呈下降趋势。综上，混合菌系的最佳装液量为30 mL。

图5 复合菌剂最佳培养条件优化Fig.5 Optimum cultivation conditions of microbial agents

2.3.5最优配方活菌数计数 以优化后的高密度发酵培养基配方和培养条件为处理，初始培养基配方和培养条件为对照，进行活菌数计数，优化后混合菌系的活菌数平均为4.6×1013cfu·mL-1，优化前平均为3.1×1011cfu·mL-1，混合菌系活菌数是配方优化前活菌数的148.39倍。

2.4 盆栽促生效应验证

盆栽试验结果表明，与原始发酵培养基及培养条件相比，经优化后的混菌发酵菌液处理植株后，青稞的株高、鲜重、叶绿素、总根长、根表面积和根体积均显著高于对照组及原始配方(P<0.05)，较原始配方分别提高了13.05%,22.83%,47.74%,73.21%,93.09%和161.54%。

表5 发酵条件优化前后菌剂对青稞生长的影响Table 5 Effect of microbial agents on the growth of barley before and after optimization of fermentation conditions

3 讨论与结论

针对不同来源的促生菌株进行发酵培养基和培养条件优化，是促生菌剂推广应用的前提和基础。有研究表明，促生菌剂初始接种量是影响促生菌在植物根际定殖的重要因素[17]。菌剂的菌体量受培养基成分[18]如碳源、氮源和无机盐的影响，适宜的培养条件(包括初始pH、温度、接种量、发酵时间、溶氧量等因素)可以有效提高菌株繁殖速率[19-20]。本研究以前期从高寒草地植物根际分离的3株PGPR菌株为基础，构建复合菌系，通过单因素试验及响应面法Box-Behnken试验设计，优化复合菌系发酵培养基及培养条件，确定复合根际促生菌剂发酵培养基为：甘油13.0 mL·L-1、蛋白胨9.0 g·L-1、酵母粉5.0 g·L-1、碳酸钙5.0 g·L-1。通过单因素试验优化发酵培养基培养条件为：pH=7.0、装液量30 mL(每150 mL三角瓶)、接种量10%、摇床转速220 r·min-1。此条件下培养48 h后菌剂活菌数达4.6×1013cfu·mL-1，较优化前活菌数提高148.39倍。李伟[21]研究发现，产抗菌肽的枯草芽孢杆菌在复合氮源成分为尿素、玉米浆和(NH4)2SO4的发酵培养基中抗菌肽产量达620.2 mg·L-1。刘芳[22]确定枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BZJN1最适培养基为玉米粉2.5%、鱼粉2.5%、蛋白胨1.5%、玉米浆0.5%、碳酸钙0.1%、硫酸镁0.03%、磷酸二氢钾0.001%，培养条件为初始pH=7.0、温度30℃、接种量4%、转速220 r·min-1。朱海云[23]通过单因素和正交试验确定了蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)MA23的最适发酵培养基和培养条件，优化后的菌体量分别提高了41.0%和28.2%。许睿娉[24]优化得到枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HG-15的培养基配方为葡萄糖4.5 g、酵母粉46.5 g,(NH4)2SO40.4 g,NaCl 10.0 g,MgSO40.8 g,MnSO40.2 g,KH2PO40.3 g,水1 000 mL，发酵条件为接种量10%、装液量50 mL(每250 mL三角瓶)、温度28℃、摇床转速200 r·min-1，发酵液菌体数量达4.167×109cfu·mL-1。上述研究与本试验所得最适发酵培养基及培养条件略有不同，可能是由于微生物菌株的来源及分类学地位的不同，导致菌株最适发酵条件也不同。针对菌株来源及应用范围的不同，优化微生物菌剂的发酵培养基及培养条件，对提高菌体生长量具有一定研究价值。同时，本研究所得发酵条件下发酵液活菌数达13个数量级，菌体量较高，表明利用相互无拮抗的菌株构建复合菌系，制备的促生菌剂具有较高的活菌数，结果与周静[25]的研究结论一致。本研究中供试菌株为芽孢杆菌属和假单胞菌属，二者均为好氧型微生物，繁殖能力较强，后续研究建议关注发酵过程中溶氧相关指标变化。利用发酵培养基进行菌剂生产时，需考虑原料价格，应选用质量稳定且价格较为便宜的原材料。本研究中所用培养基均为实验室分析级，其成本较工业用料较高，后期将结合生产实际进一步研究。

盆栽试验表明，发酵条件优化前后的复合促生菌剂对青稞均有促生作用，与优化前发酵液相比，优化后的菌剂使青稞的株高、鲜重、叶绿素含量、总根长、根表面积及根体积分别提高了13.05%,22.83%,47.74%,73.21%,93.09%和161.54%，效果显著，这与周静[25]对优化后发酵液对辣椒的促生试验结果相似。表明复合菌系在发酵条件优化后，其促生效果有所提升，其原因有待进一步研究。