丁苯酞和TLR4 抑制剂预处理对冠状动脉微栓塞大鼠心肌损伤的改善作用及其机制

黄骏文，陈志清，周游，李浪

1 广西医科大学第一附属医院心血管内科，南宁 530021；2 前海人寿南宁医院心血管内科

冠状动脉微栓塞（CME）指冠状动脉粥样硬化斑块破裂后，斑块碎片和脂质等致血栓成分流向远端微小血管引起微循环堵塞，是冠脉介入治疗（PCI）的常见并发症之一［1］。CME容易使冠脉发生“慢血流”或“无复流”，严重影响患者预后［2-3］。研究表明，炎性因子参与的心肌组织局部炎性反应，与CME 所致的心肌损伤密切相关［4-5］。

丁苯酞（NBP）在临床中广泛用于治疗缺血性卒中，具有抗炎［6］、抗氧化应激［7］、抗血小板聚集［8］、减少神经细胞凋亡［9］多种分子靶点。本课题组前期研究发现，NBP 预处理可减轻冠状动脉微栓塞大鼠心肌炎症反应并保护心功能［10］。研究显示，Toll 样受体4（TLR4）抑制剂联合右美托咪定能减轻缺氧复氧引起的心肌细胞凋亡和炎症反应，增强右美托咪定单药治疗效果［11］。然而，NBP联合TLR4抑制剂能否增强抗炎效应，增强NBP 对CME 大鼠的心肌保护作用仍未明确。2019年6月—2021年6月，本研究通过构建大鼠CME 模型，以单用NBP 作为对照，观察预先给予NBP 和TLR4 抑制剂的CME 大鼠心脏功能、心肌组织病理及TLR4 通路相关蛋白和炎性因子表达变化，以明确NBP 联合TLR4 的干预效果是否优于单用NBP，同时探讨了NBP 联合TLR4 抑制剂预处理对CME大鼠心肌损伤的改善作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂及仪器 32 只SPF 级雄性SD大鼠，体质量200～250 g，购自广西医科大学实验动物中心（动物合格证号SYXK 桂2020-0004）。实验方案通过广西医科大学动物福利与伦理委员会审查。直径45 μm 微栓塞球（美国Polyscience 公司），用生理盐水调整密度为3×104/mL。丁苯酞软胶囊（石药集团恩必普药业有限公司，批准文号：国药准字H20050299），用食用植物油调配成80 mg/mL。TLR4抑制剂TAK-242（美国APExBIO公司）。逆转录试剂盒及RT-PCR 试剂盒购自Monad 公司。 兔抗鼠TLR4、兔抗鼠MyD88、兔抗鼠NF-κB、兔抗鼠IL-1β、兔抗鼠TNF-α 单克隆抗体、β-actin 单克隆抗体及荧光羊抗兔二抗购自索莱宝科技有限公司。ALCV9A 小型动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技公司）；E-Saote Mylab 彩色多普勒B 超仪（意大利百胜公司）；NanoDrop 分光光度计、StepOnePlus荧光定量PCR 仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；T100 PCR 仪、电泳槽、转膜仪等（美国Bio-rad 公司）；FluorChem FC3 全能型成像系统（美国proteinsimple 公司）；低温离心机（德国Eppendorf 公司）；BX50 光学显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.2 大鼠分组及NBP 灌胃、TAK-242 尾静脉注射、微栓塞球左心室注射 按随机数字表法将32 只大鼠随 机分为NBP + TAK-242 组、NBP 组、CME 组、Sham组，每组8只。NBP组CME术前予NBP 80 mg／kg连续灌胃7 d，NBP + TAK-242 组在NBP 组基础上CME 术 前30 min 按2 mg/kg 尾静脉注射0.5 mg/mL的TLR4抑制剂TAK-242，其余各组同法注射4 mL/kg的生理盐水。 CME 术前予3% 戊巴比妥钠按1.5 mL/kg 腹腔注射麻醉，术区剃毛、消毒，颈正中切口暴露气管，经口气管插管，连接小动物呼吸机辅助通气，于胸骨左缘剪开皮肤，钝性分离肌肉，剪断第2～4肋骨进胸，开睑器撑开肋骨，打开心包并暴露升主动脉，用血管夹钳夹主动脉根部，CME 组、NBP组及NBP + TAK-242组立即用注射器从心尖部将直径42 μm微栓塞球混悬液0.1 mL注射至左心室，10 s后松开血管夹，Sham 组同法注射0.1 mL 生理盐水。待心跳平稳后逐层关胸，待苏醒后拔管脱机。大鼠术后6～12 h心功能明显下降，心肌病理切片可见微栓塞提示CME模型制备成功。

1.3 心功能检查 术后6 h 麻醉大鼠，超声探头频率12 MHz，测量左心室射血分数（LVEF）、短轴缩短率（FS）、左心室舒张末径（LVEDd）、左心室收缩末径（LVEDs），连续测量3个心动周期，取平均值。

1.4 大鼠心肌组织病理学观察及心肌微梗死面积的测量 术后6 h，行心脏彩超后，处死大鼠，取大鼠心底部组织，放入4%多聚甲醛固定液中浸泡，12 h后取出，石蜡包埋，切片，行HE染色，普通光学显微镜观察大鼠心肌组织病理学改变。行HBFP染色，普通光学显微镜拍照，Image J v1.80测量心肌微梗死面积。

1.5 心肌组织TLR4 mRNA 检测 采用RT-PCR法。心脏超声检查后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，沿原术口开胸取出心脏，预冷生理盐水清洗，去除心耳、心房，心尖部用干冰冷冻后转入-80 ℃冰箱保存。取心肌组织200 mg，按照TRIzol 试剂盒说明提取总RNA，并按照逆转录试剂盒说明将RNA 逆转录为cDNA。实验的特异性引物由Sangon 公司合成：TLR4上游引物：5'-CTGCATAGAGGTAGTTCCT-3’；下游引物：5'-TCCAGCCACTGAAGTTCTGA-3’。GAPDH 上游引物：5'-TGTGAACGGATTTGGCCGTA-3’；下游引物：5'-GATGGTGATGGGTTTC-CCGT-3’。按试剂说明设置反应体系及参数，用SYBRGREENI 法检测PCR 扩增产物，每个样本均做3个复孔检测，结果以2-ΔΔCT表示。

1.6 心肌组织TLR4 通路相关蛋白（TLR4、myD88、NF-κB）及炎性因子（IL-1β、TNF-α 蛋白）检测 采用Western blotting法。取心肌组织加入RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂，组织研磨仪中研磨，4 ℃、12000 r/min 离心15 min，取上清液，用BCA法检测蛋白浓度，将各组样品浓度统一调至10 μg/μL。配制10% 的分离胶和5% 的浓缩胶，每孔加样5 μL，恒压60 V 电泳，Marker分层后调至110 V 进行电泳；恒流350 mA 60 min湿法将蛋白条带转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h，置于TLR4、myD88、NF-κB、IL-1β、TNF-α 的一抗溶液（1：1000）中，4 ℃下孵育过夜，次日TBST 洗膜后放置在相应1∶10000 荧光二抗室温孵育1 h；TBST 洗膜后用化学发光液显影，全能型成像系统扫膜；最后，用ImageJv1.80测量条带灰度值。

1.7 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。采用Shapro-Wilk 检验数据是否符合正态分布，正态分布的计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，使用Levene 检验进行方差齐性检验，当方差齐时，两两比较采用LSD-t检验，当方差不齐时，两两比较采用Tambane’sT2 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能指标比较 与Sham 组相比，其余各组LVEF 和FS 下降（P均＜0.01）；与CME 组相比，NBP 组 及NBP + TAK-242 组LVEF 和FS 升高（P均＜0.01）；与NBP 组 相 比，NBP + TAK-242组LVEF 和FS 升高（P均＜0.05）。与Sham 组相比，CME 组LVEDs 增加（P＜0.01）；与CME 组相比，NBP组及NBP + TAK-242 组LVEDd、LVEDs 降低（P均＜0.01），见表1。

表1 各组大鼠心功能比较（±s）

表1 各组大鼠心功能比较（±s）

注：与Sham组相比，*P＜0.05；与CME组相比，△P＜0.05；与NBP组相比，#P＜0.05。

组别NBP + TAK-242组NBP组CME组Sham组LVEF（%）72.6 ± 2.4*△#68.9 ± 4.2*△56.4 ± 1.6*77.0 ± 2.1 FS（%）36.5 ± 2.2*△#33.5 ± 3.1*△25.4 ± 0.7*40.4 ± 2.2 LVEDd（mm）5.3 ± 0.55.1 ± 0.5△5.7 ± 0.45.4 ± 0.2 LVEDs（mm）3.4 ± 0.3△3.4 ± 0.3△4.2 ± 0.3*3.2 ± 0.1

2.2 各组大鼠心肌病理学表现及心肌微梗死面积 HE染色显示Sham 组未见微栓塞球及心肌梗死灶；其余各组均可见血管内微栓塞球，微球周围心肌细胞核溶解或消失，细胞水肿、变性，周围可见白细胞浸润和红细胞渗出。与CME 组比较，NBP 组及NBP + TAK-242 组心肌细胞结构改变较轻，炎性细胞浸润减少，见图1。HBFP 染色结果显示，Sham 组心肌组织未见明显的微梗死灶，其余各组均可见血管内微栓塞球及周围明显的微梗死灶（梗死区显红色）。Sham 组、CME 组、NBP 组、NBP + TAK-242 组的微梗死面积占比分别为3.72% ± 0.51%、17.25% ± 1.74%、13.60% ± 1.59%、11.30% ±0.51%。与CME 组相比，NBP 组及NBP + TAK-242组的微梗死面积减小（P均＜0.01）；与NBP 组相比，NBP + TAK-242 组心肌微梗死面积进一步减小（P＜0.01）。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色结果（×100）

2.3 各组TLR4 mRNA 相对表达量比较 NBP +TLR4 组、NBP 组、CME 组、Sham 组的TLR4 mRNA 相对表达量分别为1.44 ± 0.21、1.67 ± 0.47、3.18 ±0.57、0.87 ± 0.28。 与Sham 组 相 比，CME 组TLR4 mRNA 相对表达量升高（P＜0.01）。与CME 组相比，NBP 组及NBP + TAK-242 组TLR4 mRNA 相对表达量降低（P均＜0.01）。与NBP 组相比，NBP +TAK-242 组TLR4 mRNA 相对表达 水 平降低（P＞0.05），但差异无统计学意义。

2.4 各组大鼠心肌TTLR4、MyD88、NF-κB 及炎性因子蛋白相对表达量比较 与Sham 组相比，CME组、NBP 组TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、TNF-α 蛋白相对表达量升高（P均＜0.05）。与CME 组相比，NBP 组及NBP + TAK-242 组TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、TNF- α蛋白相对表达量均降低（P均＜0.05）。与NBP 组相比，NBP + TAK-242 组TLR4、MyD88、IL-1β、TNF-α 蛋白相对表达量降低（P均＜0.05）；NBP + TAK-242 组NF-κB 蛋白相对表达量降低，但差异无统计学意义（P均＞0.05），见表2、图2。

表2 各组大鼠心肌TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-1β相对表达量比较（±s）

表2 各组大鼠心肌TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-1β相对表达量比较（±s）

注：与Sham组相比，*P＜0.05；与CME组相比，△P＜0.05；与NBP组相比，#P＜0.05。

组别NBP + TAK-242组NBP组CME组Sham组TLR40.70 ± 0.28△#0.89 ± 0.20*△0.96 ± 0.22*0.77 ± 0.23 MyD880.64 ± 0.19△#0.87 ± 0.25*△1.08 ± 0.27*0.61 ± 0.11 NF-κB 0.70 ± 0.28△0.88 ± 0.27*△1.12 ± 0.31*0.58 ± 0.18 TNF-α 0.81 ± 0.16△#1.13 ± 0.20*△1.23 ± 0.27*0.77 ± 0.23 IL-1β 0.73 ± 0.16*△#0.97 ± 0.21*△1.05 ± 0.23*0.56 ± 0.18

图2 各组大鼠心肌组织TLR4通路相关蛋白及炎性因子的电泳图（Western blotting）

3 讨论

研究显示，CME 可导致心肌损伤及近、远期心功能明显下降，与急性ST 段抬高型心肌梗死患者PCI 治疗后1年内心衰的病死率和住院率密切相关［3］。炎性因子参与CME 后心肌组织局部炎性反应，心肌炎症反应与CME 后心肌收缩功能障碍密切相关［4-5］，抑制炎症因子水平、减轻CME 后心肌炎症反应可改善CME后心功能［12-13］。

NBP 有多种生物靶点，研究表明NBP 能减轻神经血管炎症，保护神经功能［14-15］。BAI 等［6］研究发现，NBP 可抑制大鼠急性心肌梗死后IL-1β、TNF-α表达，减轻炎症反应，抑制心肌细胞凋亡。QIU 等［16］发现在大鼠心力衰竭模型中，NBP 能抑制TNF-α 蛋白表达水平，保护心功能。在前期研究中，我们也发现NBP 预处理能减少CME 大鼠心肌IL-1β、TNF-α表达水平，减轻心肌炎症反应，并改善CME 大鼠心功能［10］。

TLR4/MyD88/NF-κB 信号传导通路与心肌炎症反应、心肌细胞凋亡等密切相关［17］。SU 等［18］发现使用TLR4 特异性抑制剂TAK-242 可有效抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路激活，减轻CME 后心肌炎症反应，改善心功能。另外，在大鼠CME 模型中，使用大蒜素、尼可地尔等同样能抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活，减轻CME后心肌炎症反应［19-20］，提示阻断TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路可能成为减少CME 后心肌损伤的有效方法。本研究针对NBP 联合TAK-242 能否增强抗炎效应，提高NBP保护CME所致心肌损伤的作用进行了研究。

本研究发现，CME 后6 h 大鼠心功能下降，心肌组织HE 染色可见血管内微梗塞球及周围坏死心肌组织，白细胞浸润明显，心肌炎症因子水平升高，而给予NBP 可明显改善这种变化，与前期实验结果基本一致。通过进一步检测，我们发现CME 大鼠心肌组织TLR4 在mRNA 及蛋白水平的表达明显升高，同时TLR4 调控的MyD88、NF-κB 蛋白水平均升高，提示CME 后TLR4 信号通路激活参与调控CME后大鼠心肌炎症反应。给予NBP 后，大鼠心肌组织TLR4 mRNA 及蛋白水平的表达明显降低，TLR4 调控的MyD88、NF-κB 蛋白及炎症反应因子IL-1β、TNF-α水平均降低，提示NBP可能通过抑制TLR4表达，抑制TLR4信号通路激活，减轻CME 大鼠心肌炎症反应。在NBP 联合TAK-242 预处理后，CME 大鼠心肌TLR4 及下游通路蛋白水平进一步降低，心肌微梗死面积进一步减少，大鼠心功能进一步改善，说明NBP 联合TAK-242 能协同抑制TLR4 通路激活，进一步减轻心肌炎症反应，减轻心肌损伤，提高NBP单独用药对CME大鼠心肌损伤的保护作用。

综上所述，NBP 联合TAK-242 可能通过协同抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路信号激活，减轻CME 所致的心肌炎症反应，从而减轻心肌损伤，改善心功能。NBP 联合TAK-242 可能为防治CME 所致心肌损伤提供新的线索与方向。