宏基因二代测序技术在重症肺炎病原体检测及治疗方案制定中的应用

张安兵，袁小玲，夏秀琼，吕燕华，张丹丹，梁剑平

中山市人民医院呼吸与危重症医学科，广东 中山 528400

重症肺炎是临床常见危重疾病之一，病死率20%～50%［1］，快速确定病原体并进行针对性抗感染治疗尤为重要［2］。传统痰、灌洗液培养阳性率低、周期长，不能有效指导临床抗感染治疗。宏基因二代测序技术（mNGS）是借助二代测序平台快速测序获得样品中的核酸序列，并进一步与各个物种的基因组序列对比，从而得知样品中微生物种类的技术［3］。mNGS被逐渐应用于探究疑难感染病原体，但目前将该技术应用于重症肺炎病原体的诊断及治疗中的研究鲜见报道。本研究以传统病原体培养为对照，探讨mNGS 在重症肺炎病原体检测及治疗方案制定中的应用效果。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取中山市人民医院2019年1月—2021年6月收治的重症肺炎患者112例，男55例、女57例，年龄18～85（61.72 ± 11.35）岁。患者入院时均予经验性抗感染治疗及其他常规治疗，需有创机械通气者行气管插管，外接呼吸机机械通气（美国鸟牌8400 型呼吸机）。纳入标准：①符合2019年美国感染病学会/美国胸科学会（IDSA/ATS）“成人社区获得性肺炎诊治指南”对重症肺炎的诊断标准［1］。主要标准：需要气管插管行机械通气治疗；脓毒症休克经积极液体复苏后仍需要血管活性药物治疗。次要标准：呼吸频率≥30 次/min；氧合指数≤250；多肺叶受累；意识障碍；血尿素氮≥20 mg/dL；白细胞计数＜4×109/L；血小板计数＜100×109/L；体温＜36 ℃；低血压需要液体复苏。符合1条主要标准，或至少3项次要标准可诊断。②年龄≥18 岁。排除标准：结缔组织疾病累及肺部；患获得性免疫缺陷综合征者；粒细胞缺乏者；严重肝功能、肾功能损害者；妊娠或哺乳期妇女；存在纤支镜检查禁忌证者。患者均签署知情同意书，本研究获医院伦理委员会审核通过。将符合入选标准的112 例患者采用随机数字表法分为实验组和对照组，各56 例。实验组男26 例、女30例，年龄（62.57 ± 12.52）岁，BMI（21.23 ± 3.45）kg/m2，有吸烟史21 例，合并基础疾病41 例，行机械通 气 治 疗48 例，氧 分 压（PO2）为（63.21 ±7.96）mmHg，氧合指 数（PaO2/FiO2）为（197.16 ±11.87）mmHg，白细胞（WBC）为（17.63 ± 4.63）×109/L，中性粒细胞比例（N%）为87.87% ± 8.53%，C-反应蛋白（CRP）为（155.72 ± 13.26）mg/L，降钙素原（PCT）为（3.83 ± 0.83）ng/mL，急性生理与慢性健康评分（APACHE II评分）为（16.73 ± 6.57）分；对照组男29 例、女27 例，年龄（60.91 ± 11.84）岁，BMI（20.65 ± 2.83）kg/m2，有吸烟史26 例，合并基础疾病43 例，行 机 械 通 气 治 疗45 例，PO2（62.73 ±8.37）mmHg，PaO2/FiO2（198.97 ± 13.24）mmHg，WBC（18.26 ± 5.13）×109/L，N%（86.96 ± 7.97）%，CRP（157.73 ± 14.25）mg/L，PCT（3.76 ± 0.95）ng/mL，APACHE Ⅱ评分（17.38 ± 7.19）分。两组上述指标比较，P均＞0.05。

1.2 病原体检测的宏基因二代测序法 患者均由5年以上操作经验的纤支镜医师完成纤支镜肺泡灌洗术；患者在咪达唑仑静脉镇静下，经气管插管或鼻腔进镜，2% 利多卡因气道黏膜表面麻醉，选取病变严重的段支气管，将支气管镜顶端嵌顿在支气管树分支，注入生理盐水60～120 mL 灌洗，然后以100 mmHg 负压抽吸，回收率40%～60%，回收的灌洗液装入灭菌容器中，灌洗液培养样本量不少于10 mL。实验组患者肺泡灌洗液样本收集后立即干冰保存送深圳华大基因行mNGS 检测（DNA 检测），mNGS 标本的采集、保存和运输严格按照该公司标准化规范执行。

取3～5 mL 肺泡灌洗液置于离心试管中，将试管置于4 ℃环境中，以4000 r/min 高速离心10 min，按照TIANamp Micro DNA Kit（DP316，天根生化科技（北京）有限公司）试剂盒说明书提取DNA。将提取到的样本DNA 超声破碎至150 bp 左右的片段。使用Agilent 2100 Bioanalyzer 质控文库插入片段大小为200～300 bp，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher Scientific Inc）质控DNA文库浓度，经环化形成单链环形结构。环化后的文库经滚环复制生成DNB 纳米球。制备好的DNB 纳米球加载到测序芯片，使用BGISEQ-50/MGISEQ-2000 进行测序。测序数据下机后去除低质量短片段（长度＜35 bp）获得高质量的测序数据。通过BWA（BWA：http：//bio-bwa.sourceforge.net/）测序分析软件将高质量数据中比对到人参考基因组序列的数据去除。剩下的数据在去除低复杂度序列后与细菌、真菌、病毒、寄生虫4 个微生物大数据库进行比对，获得能够匹配到某种病原体的序列数，根据序列数的高低以及临床其他检测来判断可能的病原体。患者根据肺泡灌洗液mNGS结果调整抗感染方案。

对照组患者肺泡灌洗液标本送本院检验医学中心行一般细菌、真菌培养，并根据肺泡灌洗液培养结果及其他检查结果调整抗感染方案。

1.3 mNGS 应用效果的评定 比较两组病原体检出率。治疗结束后比较两组患者抗生素的使用时间、机械通气时间、住院日、住院费用、临床疗效、病死率的差异。临床疗效评价采用三级标准。治疗第二周参照金平珍等［4］文献公布的标准，分显效、有效、无效3 级，显效和有效合计为总有效。显效：体温、呼吸道症状及体征、实验室检查（包含血象、CRP、PCT）均恢复正常，影像学恢复正常或大部分吸收（病变吸收≥50%）。有效：体温、呼吸道症状及体征、实验室检查均恢复正常或明显好转，影像学有吸收。无效：体温、呼吸道症状及体征、实验室检查至少有一项改善不明显甚至恶化，或一度改善后又恶化，影像学无吸收或进展；有效率=（显效+ 有效）/总例数×100%。统计患者28 d病死率。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料用Shapiro-Wilk 法进行正态分布检验，如符合正态分布以±s表示，比较采用两个样本独立的t检验；如为偏斜分布数据则以中位数（四分位数间距）表示，比较采用秩和检验。计数资料用例数（%）表示，比较使用χ2检验。用Kaplan-Meier方法得出累积有效率和病死率。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mNGS 在重症肺炎病原体检测中的应用效果实验组检出细菌26例（铜绿假单胞菌4例，肺炎克雷伯菌5例，鲍曼不动杆菌6例，肺炎链球菌2例，金黄色葡萄球菌4例，嗜肺军团菌2例，奴卡氏菌1例，黏质沙雷菌1 例，洋葱伯克霍尔德菌1 例），真菌14 例（白色念珠菌4例，耶氏肺孢子菌6例，烟曲霉4例），病毒6例（人类疱疹病毒1型3例、人类疱疹病毒5型2 例、巨细胞病毒1 例），鹦鹉热衣原体4 例，结核分枝杆菌1例，堪萨斯分枝杆菌1例。对照组检出细菌22例（铜绿假单胞菌4例，肺炎克雷伯菌5例，鲍曼不动杆菌6例，肺炎链球菌2例，金黄色葡萄球菌4例，黏质沙雷菌1例），真菌7例（白色念珠菌4例，烟曲霉菌3 例）。实验组灌洗液mNGS 病原体检测阳性率92.85%（52 例/56 例），对照组灌洗液培养阳性率51.78%（29例/56例），两组比较，χ2=23.59，P＜0.05。

2.2 mNGS 在重症肺炎病原体治疗方案制定中的应用效果 ①两组临床疗效比较：治疗2 周后实验组显效29 例、有效21 例、无效6 例；对照组显效14例、有效28例、无效14例。实验组、对照组有效率分别 为89.29%、75.00%，两 组比 较，χ2=3.895，P=0.048。②两组机械通气时间、抗菌药物使用时间、抗菌药物调整频次、ICU 停留时间、住院日、住院费用比较：两组抗菌药物使用时间、抗菌药物调整频次、ICU 停留时间、住院日、住院费用比较，t 分别为3.851、5.095、11.717、4.155、5.094、5.306，P 均＜0.05，见表1。 ③病死率：实验组患者死亡6 例（10.71%），对照组患者死亡10例（17.85%），两组病死率比较，χ2=1.037，P=0.308。

表1 两组机械通气时间、抗菌药物使用时间、抗菌药物调整频次、ICU停留时间、住院时间、住院费用（±s）

表1 两组机械通气时间、抗菌药物使用时间、抗菌药物调整频次、ICU停留时间、住院时间、住院费用（±s）

组别实验组对照组n 5656机械通气时间（d）8.69 ± 4.7312.35 ± 5.31抗菌药物使用时间（d）16.43 ± 2.7119.46 ± 3.53抗菌药物调整频次（次）2.36 ± 0.533.71 ± 0.68 ICU停留时间（d）10.69 ± 4.6414.75 ± 5.65住院时间（d）18.46 ± 2.6421.93 ± 4.36住院费用（万元）6.61 ± 1.057.92 ± 1.52

3 讨论

重症肺炎高病死率与约60% 患者不能明确感染病原体有关［5］，感染病原体不明严重影响了经验性抗感染治疗效果，尽早明确感染病原体并进行针对性抗感染是治疗重症肺炎的关键。传统病原体培养条件要求高、周期长、阳性率低，且抗生素使用影响其培养［6］；因此，临床亟需新的检测技术来快速、准确找到感染病原体，给予精准抗感染治疗，改善患者预后。

mNGS能一次性对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，能够检测出可培养和不可培养微生物的基因序列，绕过了微生物的分离和培养过程，具有病原体检出阳性率高、快速、灵敏度高等特点，且不受宿主因素、抗生素及激素使用等因素的影响［7-9］。本研究中实验组灌洗液mNGS病原体检出率达92.85%，明显高于对照组的51.78%。实验组患者感染病原体占比由高到低依次为细菌、真菌、病毒、其他病原体，细菌中以革兰阴性菌为主，革兰阴性菌中又以铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌为主，革兰阳性菌以金黄色葡萄球菌为主。因此，对重症肺炎经验性抗感染时可考虑抗铜绿假单胞菌的β-内酰胺类药物、氟喹诺酮类药物，必要时加用万古霉素。实验组检出真菌14例，我们发现这些患者均为长期使用激素或免疫抑制剂或免疫力低下人群，对这类患者应常规完善G 试验、GM 试验检查，尽早经验性抗真菌治疗；另外，该组中检出耶氏肺孢子菌6 例（42.85%），临床上经验性抗感染可考虑予伏立康唑联用复方磺胺甲噁唑。实验组检测出奴卡氏菌、结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌等少见病原体，而这些病原体传统培养条件要求极高，一般需在结核病专科医院培养，提示mNGS 可提高少见病原体的检出率。孙雯雯等［10］报道mNGS 诊断肺结核的敏感度为59%，显著高于涂片法（15%）和培养法（26%），但与Xpert 法（52%）比较差异无统计学意义（P=0.090）。缪青等［11］研究报道，mNGS 对非结核分枝杆菌感染的诊断价值与传统培养法相比无显著优势（24.7%vs.21.9%），考虑与非结核分枝杆菌较难破壁以及不同公司的破壁技术有关，他们建议改进对该类菌的检测技术。对于大量的非结核病专科医院而言，mNGS 在非结核分枝杆菌的检测中仍然有很好的应用价值。本研究中有4例重症肺炎患者最后通过mNGS 确诊为鹦鹉热衣原体感染，据报道鹦鹉热衣原体肺炎占社区获得性肺炎约1%［12］，传统的血清学检测或PCR 检测敏感性、特异性均不高，且该病原体极难培养，以前受限于检测条件的限制大部分患者被漏诊或误诊，随着mNGS 技术的推广该病越来越多被报道［13-15］；对有禽类接触史，以发热、乏力、肌肉酸痛等流感样症状为主的肺炎患者应考虑该病可能，可予多西环素或喹诺酮类经验性治疗。病毒在医院的普通实验室极难培养，对于病毒性肺炎的诊断一直是临床难题，既往多通过病毒核酸或抗体检测，而这两种方法敏感性、特异性均不令人满意，临床多结合病史、胸部CT 表现进行经验性诊断，对患者的准确诊断、诊疗均严重滞后。本研究中实验组检出病毒感染6例，而对照组未检出病毒，说明mNGS在病毒感染的诊断中具有较好的效果。

肺炎患者大部分病原体诊断不明，尤其重症患者需长期、大剂量使用广谱抗生素，使得病原菌对抗菌药物的耐药率不断升高，这是当前亟待解决的全球性问题。本研究显示，通过mNGS 及早明确病原体，及时调整治疗方案，明显降低了抗菌药物调整频次及使用时间，这给抗菌药物的管理提供了一个新的方向。随着技术的进步，我们期待mNGS 能对耐药基因进行检测，更好指导临床抗感染治疗。同时发现，实验组临床治疗有效率更高，住院时间、住院费用更低，改善患者预后的同时减少了其经济负担。在ICU 患者中机械通气时间越长，发生呼吸机相关院感的风险越高。本研究中实验组患者呼吸机使用时间、ICU 停留时间明显缩短，大大降低了发生院感的风险。上述结果均提示mNGS 在指导重症肺炎患者治疗方案的选择上起到了积极的作用。本研究中对照组患者病死率高于实验组，但差异无统计学意义，考虑可能与样本量偏少有关。

综上所述，mNGS 应用于重症肺炎患者能提高病原体检出率，提高患者临床疗效，缩短抗生素使用时间、机械通气时间，减少住院时间及住院费用。但本研究为单中心研究，尚有不足之处，期待更大样本量的多中心研究验证。