固载乳酸菌发酵中药槐角研究

金爽，白雪，许雯惠，陈威沛，吕晨，程玉鹏，崔喆，匡海学

(黑龙江中医药大学 教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040)

槐角(Fructus Sophorae)为豆科植物槐的果实，作为一味常用的中药，可止血凉血、清热泻火，性苦、寒，归肝，大肠经。槐角中富含黄酮类和异黄酮类化合物，如染料木素、染料木苷、槐角苷、槐角双苷等[1-3]。其中，染料木素等异黄酮类化合物是槐角中最主要的成分和标志性活性物质[4-6]。众所周知，染料木素具有雌性激素及抗雌性激素性质，可以抑制拓扑异物酶Ⅱ的活性和酪氨酸蛋白激酶PTK的活性，因其抑菌、降血脂、抗氧化等作用已成为国际上的研究和开发热点。微生物转化具有较高的立体选择性、基团选择性和区域选择性。与化学反应相比，具有反应条件温和、后处理简单、污染小、成本低等优点。近年来，随着生物技术的飞速发展，微生物转化发酵炮制的基础研究和应用研究得以大力发展，但传统的微生物转化炮制主要以真菌为主，其效果虽好，安全性有待考量。益生菌作为研究热点一直备受关注，应用益生菌对中药材进行发酵炮制也逐步成为研究的热点[7-9]。乳酸菌作为代表性的益生菌以其无毒并具有独特的生理功效受到了国内外研究人员的广泛关注，通过乳酸菌发酵中药拥有广阔的发展前景[10]。

本文对槐角提取物中染料木素的含量进行了测定，以乳酸菌发酵炮制槐角后染料木素的含量为衡量指标，通过对pH、温度和料液比等影响因素进行了单因素考察试验，并结合中心组合设计试验和固载微生物技术，采用固载乳酸菌发酵处理中药槐角，对槐角的最佳发酵条件进行初步研究，优化出最佳的发酵条件，并对槐角乳酸菌转化发酵生产染料木素过程进行研究，同时考察发酵过程中总黄酮的含量变化，为乳酸菌发酵炮制中草药领域的进一步深入研究探索及相关开发提供了理论依据。

1 材料

槐角购自黑龙江省哈尔滨市药材市场，经黑龙江中医药大学药学院苏连杰教授鉴定为药典收载品种；乳酸乳球菌购自黑龙江省微生物研究所；HZQ-C空气浴振荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；BPH-9162精密恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；其他试剂均为市售分析纯。

2 方法

2.1 固载乳酸乳球菌菌液的制备

向培养好的乳酸乳球菌培养皿中加入20 mL灭菌后的蒸馏水，将菌种用接种环轻轻刮下，混合均匀备用。

2.2 固载乳酸乳球菌菌球制备

室温下，取3 mL均匀乳酸乳球菌菌液加入到6 mL浓度为5%的海藻酸钠溶液中，用注射器量取混合液滴入到3%氯化钙溶液中，迅速搅拌，制成直径约为5 mm的菌球，形成形状完好的菌球后静置2 h，用无菌水冲洗3次得到固载菌球。

2.3 发酵基质的制备

将槐角研粉碎后过80目筛，称取1 g槐角粉末投到含有50 mL无糖马铃薯液体培养基中，121 ℃条件下高压灭菌30 min，制备得到发酵基质，备用。

2.4 固载乳酸菌发酵过程

将制备得到的固载乳酸乳球菌球投入到发酵基质后，在37 ℃恒温条件下进行摇床培养。

2.5 发酵中药槐角后染料木素的提取

将培养后的槐角和固载乳酸乳球菌用滤纸过滤，使发酵液与槐角和固载乳酸乳球菌分离。将发酵液旋转蒸干，加入适量80%乙醇，超声后得到溶解液。然后，再向过滤分离得到的槐角和固载球菌中加入适量80%乙醇溶液，超声提取30 min，滤纸过滤，重复提取2次，合并提取液，且将上述溶解液和提取液合并，旋转蒸干，加入80%乙醇定容至50 mL，于12 000 r/min离心以备用。

2.5.1 标准曲线的制备

精密称取芦丁对照品，加入乙醇，置于水浴溶解，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得芦丁标准品溶液(芦丁含量为0.2 mg/mL)。吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL芦丁标准溶液，分别置于10 mL容量瓶内，加入30%乙醇至2 mL，再加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL放置8 min，加入10 %硝酸铝溶液0.5 mL放置8 min，分别加入4 %氢氧化钠溶液4.0 mL，定容后摇匀，放置15 min。以0 mL的容量瓶内试剂为空白，在510 nm波长处测定吸光度。以芦丁浓度作为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，求得回归方程。

2.5.2 样品溶液的制备

取实验样品，挥干溶剂，量取3 mL无水乙醇于10 mL容量瓶，加蒸馏水定容后，用等体积石油醚依次萃取，脱脂、脱色素，取水层用于总黄酮的含量测定。

2.6 发酵中药槐角后染料木素的检测

测定在不同pH值(4.0、5.0、5.5、6.0、7.0)、不同时间(12、24、36、48、60 h)、以及不同液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g)下中药槐角炮制后发酵体系中染料木素的含量，确定槐角的最佳发酵条件。

2.7 中心组合设计法优化发酵体系条件

根据2.6发酵中药槐角后染料木素的检测中单因素优化的试验结果，选择对该体系中有显著作用的3个因素，采用中心组合法进行3因素3水平试验，并结合响应面法对试验进行进一步优化，研究这3个因素不同水平下的组合对炮制槐角发酵体系中染料木素含量的影响。

3 结果

3.1 固载乳酸菌发酵炮制槐角色谱相图

槐角原药材中染料木素含量为(6.53±0.06)mg/g，经过发酵优化为(18.93±0.47)mg/g，可达原药材的2.90倍，见图1。

注：A.中药槐角原药材；B.中药槐角经固载乳酸菌炮制后。

3.2 固载乳酸菌发酵总黄酮的变化分析

据分析，得到标准曲线为y=1.221 4x-0.019 2(R=0.998)，总黄酮含量原药材为(74.00±0.42)mg/g，发酵36 h时总黄酮含量可达(122.00±0.56)mg/g，见表1。

表1 乳酸菌发酵槐角前后总黄酮含量变化

3.3 固载乳酸菌发酵体系单因素优化

本试验对固载乳酸菌槐角发酵体系的条件进行了单因素优化，考察了pH值、时间、液料比3个因素，试验结果见表2～4。

表2 不同pH发酵槐角前后染料木素含量变化

由表2可得，pH值对发酵过程有较大的影响，当发酵基质的pH值为5.0时，槐角体系中的染料木素含量达到最大值6.24 mg/g。pH 在4.0～5.0时，槐角体系中染料木素的含量逐渐增加，而pH在5.5～7.0时，染料木素的含量开始下降。pH作为微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，对菌体的生长和产品的积累有很大的影响，上述发生的变化取决于菌种的特性和产物的化学性质，而pH值的变化会影响酶活力的改变，以致影响产物的合成，但pH值过高会使酶失活而无法发挥其活性，从而导致生成产物的含量降低。

将该体系放置在pH值为5.0的培养基中培养，测定不同的发酵时间染料木素的含量。由表3可知，当发酵基质的发酵时间为36 h时，槐角体系中的染料木素含量达到最大值11.73 mg/g。时间在12.0～36.0 h范围内，槐角体系中染料木素的含量逐渐增加，而在48～72 h时，染料木素的含量逐渐降低。这是因为在发酵过程中存在最适发酵时间，发酵时间过短发酵不完全，过长则损失更多的营养，导致降剩下的量显著降低，从而影响染料木素的含量。

表3 不同发酵时间发酵槐角前后染料木素含量变化

将纳豆菌发酵槐角体系放到按照不同的液料比配制好的培养基中进行培养，由表4可知，液料比对发酵过程影响颇大，当发酵基质的液料比为25 mL/g时，槐角体系中的染料木素含量达到最大值为18.93 mg/g。液料比在15.0∶1～5.0∶1 mL/g范围内，染料木素的含量逐渐增加，而在25∶1～35∶1 mL/g时，染料木素的含量逐步下降。分析出现上述的原因是合适的培养基给细胞提供了充足的氧气，而培养基的配比过量会影响酶的活性，使其活性降低。

表4 不同液料比发酵槐角前后染料木素含量变化

3.4 中心组合设计法优化固载乳酸菌发酵槐角条件

按照单因素试验结果，选择pH(A)、液料比(B)和发酵时间(C)作为中心组合设计的三个优化因素，具体见表5、表6和表7。

表5 中心组合试验因素与水平表

表6 中心组合试验设计方案与结果

表7 二次中心组合设计方差分析表

选择中心组合法对固载乳酸菌发酵槐角的条件进行响应面试验，继而应用相关的软件对结果进行回归分析和方差分析(表 5、6)，用槐角体系中染料木素的含量作响应值(Y)，自变量为pH值、发酵时间、液料比的二次多元回归方程：Y=18.82-0.022A+0.68B+1.02C-0.030A×B-0.012A×C+0.24B×C-0.75A2-1.40B2-0.78C2

据表7可得，P<0.000 1，说明差异极显著；而模型失拟项是表示模型中的理论值与实际值不相拟合的概率，本部分中的失拟P=0.0515>0.05，说明模型的失拟度不显著。

如图2(a～c)，随意两个交互因素的响应面都有最高值。据分析，发酵时间和料液比对发酵槐角的影响较大，而pH值的影响相对较小。通过软件分析，最佳发酵工艺为：发酵时间为36 h、pH 5.0、料液比为25∶1(mL/g)，在此条件下发酵槐角得到的染料木素含量为(18.93±0.47)mg/g，是原药材的2.90倍，而最优条件下的总黄酮含量为(122.00±0.56)mg/g。

注：a.pH和液料比响应面图；b.pH和发酵时间响应图；c.液料比和发酵时间响应图。

4 讨论

本研究以槐角中总黄酮含量和染料木素含量为指标，对固载乳酸菌炮制槐角发酵体系进行了研究，在单因素试验的基础上结合响应面法，对固载乳酸菌发酵槐角的条件进一步优化，得到槐角最佳的发酵条件为pH 5.0，液料比25∶1(mL/g)，发酵时间36 h，发酵后得到最优染料木素含量为(18.93±0.47)mg/g，是原药材的2.90倍，而最优条件下总黄酮为(122.00±0.56)mg/g，远高于未处理时槐角原药材的含量。

该研究将益生菌微生物转化与固载技术结合发酵炮制中药槐角，消除了传统炮制方法的弊端，研究结果为槐角的进一步的开发利用提供了理论基础，为创新技术的发展提供了依据。