分子生物学技术在绵羊毛、山羊绒鉴别中研究应用进展

费静 陈晓 刘敏华 葛存卿 秦皓

摘 要：山羊绒、绵羊毛外观相似，理化性质相近，这是传统检测方法无法客观区分两者最主要的原因。为从根本上解决这个问题， 科研人员从生命最本质的特征入手，开发了针对特种动物纤维角蛋白检测方法，以及毛髓细胞内的遗传物质DNA的检测方法。文章简述了检测的基本原理、发展历程、应用范围及存在的问题，对目前存在的几种分子生物学检测方法作了较为系统的比较分析。其中，DNA检测灵敏度高，但使用范围受限;蛋白检测方法较为稳定，易于实现多种混合物的定性检测，但灵敏度不及DNA检测法。总之，分子生物学检测法是传统检测法的有益补充，在其适用范围内，可以提供客观一致的检测结果。

关键词：羊绒;羊毛;DNA;蛋白质;鉴别

中图分类号：TS137

文献标志码：A

文章编号：1009-265X（2022）01-0036-05

Abstract： Similarity between cashmere and sheep wool in appearance， physical and chemical properties are two main reasons why traditional detection methods can't distinguish them objectively. To solve this problem fundamentally， starting from the most essential characteristics of life， researchers developed a new detection method for fibrokeratin of special animals and a detection method for the genetic material DNA in medullary cells. This review provides a systematic comparative analysis of several existing molecular biological detection methods， and focuses on the basic principle， development history， application scope and existing problems of these methods. Among them， DNA detection features a high sensitivity， but a limited applicable scope. While protein analysis is more stable， and easy to achieve qualitative detection of a variety of mixtures， but its sensitivity is not as good as that of DNA detection. In conclusion， molecular biological detection methods are a good supplement to traditional methods and can provide objective and consistent results within their scope of application.

Key words： cashmere; wool; DNA; protein; identification

山羊绒因其纤细、柔软、保暖的特点，长期占据着高档面料原料榜首。物以稀为贵，凭借其优异的性能和产量的稀缺性，山羊绒价格较高，利欲熏心的不法分子在山羊绒中掺入价格较低的其他纤维，如羊毛、牦牛绒等，以次充好，牟取暴利，侵害了消费者的权益[1]。美国、欧盟、日本等国均制定了相应的标签法规，打击以次充好，维护市场的公平公正。中国是山羊绒的主要出口国，这种欺诈行为，也有损中国羊绒生产大国的形象。这就对检测监管部门提出了更高的要求。过去传统的检测方法，主要从山羊绒和绵羊毛的外观形态入手，借助显微镜、电镜等放大成像设备进行鉴别[2]。纤维的染色及其他复杂的加工工艺掩盖了鳞片厚度形态等鉴别指标，此外改性绵羊毛、拉伸羊毛、剥鳞羊毛等的掺入，进一步增加了检测难度。这类基于外观形态的检测方法，准确度受限于检测人员的经验，结果较为主观[3-4]。随着计算机技术的不断发展，以深度学习为代表的视觉成像识别技术也取得了突破性进展，研究人员建立了以AI为基础，结合自动图像处理技术的纤维鉴别检测方法，实现羊毛、羊绒的自动化、智能化检测。这一方法的特点在于重复性好，检测效率高，但方法的准确度有赖于谱图库的不断完善。

人们对生物体的认知隨着生命科学的发展已逐渐深入到微观水平。山羊绒是山羊身上隐藏于粗毛根部的底绒，而羊毛则来自绵羊，山羊（Capra hircus）和绵羊（Ovis aries）在动物学分类上同科不同属。既然如此，它们在分子层面一定存在着物种特异的可区分的特征。

1 脱氧核糖核酸（DNA）水平

1.1 检测原理

DNA即脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid），是染色体主要组成成分，同时也是主要遗传物质。每个单核苷酸又由3种比较简单的化合物即磷酸、脱氧核糖和碱基各一分子组成。碱基有嘌呤和嘧啶两大类，嘌呤中主要有腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G），嘧啶中主要有胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。单个脱氧核糖核酸通过磷酸二酯键连接形成长链。DNA检测的依据是物种特异的核糖核苷酸组成排列，具有客观、精确的特点，近年来在司法鉴定、动植物检疫、食品安全、环境监测等领域得到了广泛的应用。检测的基础是PCR技术。PCR技术是一种体外模拟DNA扩增的技术，短时间内能将微量的DNA大量增加。从毛发中获得足够量，且比较完整能进行PCR扩增的DNA成了制约该技术发展的一个瓶颈。毛发DNA种属鉴别长时间停滞不前，是由于过去的研究集中在细胞基因组DNA上，而基因组DNA大量集中于带毛囊的动物纤维中，在毛干中的含量极少，一旦纤维经过染整后就难检测到了。直到2004年印度科学家Subramanian等[5]将研究重点转移到线粒体DNA上，大大推进了这项技术在特种动物纤维鉴别中的研究应用。

1.2 定性检测

美国科学家hamalyn等[6]对DNA分析定性检测特种动物纤维做了最早的尝试。1992年，他们利用探针杂交技术，设计了特异性结合绵羊DNA的绵羊探针，从而可以区分羊毛与羊绒、马海毛等其他纤维，但受限于当时生物技术水平，仍存在诸多缺点，无法推广。线粒体DNA广泛存在于皮质细胞中，每个细胞中存在多个拷贝，相较基因组DNA更容易得到。kerkhoff等[3]于2009年实现了物种特异性PCR区分鉴别羊毛、羊绒、骆驼毛、牦牛毛等纤维，实现了快速简便的纤维定性分析，但同样存在着无法精确定量分析混合纤维的问题。

ISO18074：2015《纺织品 DNA分析法鉴别某些特种动物纤维 山羊绒、绵羊毛、牦牛绒及其混合物》通过设计针对山羊绒、绵羊毛、牦牛绒的线粒体DNA的物种特异性引物，对经抽提纯化的DNA进行PCR扩增，通过特定长度片段的电泳迁移来确认动物纤维的种类[7]。该方法实现了山羊绒、绵羊毛、牦牛绒的定性鉴别。该标准是首个利用DNA检测进行动物纤维鉴别的标准。

1.3 定量检测

荧光定量PCR是PCR技术的升级，可通过荧光信号实现对DNA扩增的监控，不仅能对物种进行定性，还能进行定量。

课题组研究利用了TaqMan荧光定量PCR技术实现了山羊绒、绵羊毛的定量检测。针对山羊绒、绵羊毛种内保守，种间差异的线粒体DNA区段设计了特异性的引物探针，通过使用已知含量的标准混合物建立定量标准曲线，实现未知样品的检测。收集不同产地、年龄段的山羊绒进行方法的验证，证明了线粒体DNA的数目在动物毛发中是相对稳定的，该定量方法具有普适性[4]。荧光定量PCR法与普通PCR相比，是闭管检测，减少了污染因素，且能实现山羊绒、绵羊毛相对定量检测，是一个质的飞跃。

GB/T 36433-2018《纺织品 山羊绒和绵羊毛的混合物DNA定量分析 荧光PCR法》就是该研究的应用。灵敏度高，重复性好，可检测到1%的甚至更低的异质纤维掺入[8]。该定量方法是一种相对定量检测，对相同组成的山羊绒、绵羊毛混合物，经过同样的染色、后整理等处理，均能得到一致的含量检测结果[9]。

1.4 存在的问题

DNA检测的适用范围有一定的限制。完整的一定量的DNA是进行PCR检测的必要条件。对于某些过度处理，尤其经氧化剥色的纤维定量结果不准确，原因是DNA链不耐受强氧化剂，链断裂后PCR反应无法进行。另外，山羊绒回用纤维常因多次染色，其处理程度与相混合的绵羊毛不一致，也会导致检测结果不准确。因而GB/T 36433-2018对标准的适用范围作了严格的限制。

2 蛋白水平的检测

2.1 检测原理

角蛋白是毛发纤维的重要组成部分[10]，DNA中存在物种差异，也会反映到表达的蛋白中。角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，由于角蛋白含有较多的胱氨酸，故二硫键含量特别多，在蛋白质肽链中起交联作用，因此角蛋白化学性质特别稳定，有较高的机械强度。由于蛋白的分子量比较大，需要温和地将角蛋白溶解下来，通过一定的分离，找到山羊绒和绵羊毛存在物种差异的角蛋白区域，对存在物种差异的多肽片段进行检测。

2.2 定性定量检测

意大利科研人员率先进行了蛋白免疫反应鉴别山羊绒和绵羊毛的大胆尝试，使用免疫小鼠产生的抗山羊的单克隆抗体进行山羊绒和绵羊毛的鉴别分析，该方法可以实现定性鉴别和粗略的定量检测，但受限制于蛋白提取的产率和重复性，以及免疫检测步骤的繁琐性，未大面积推广[11]。Sara等[12]在前人的基础上，开发了仪器检测蛋白指纹图谱鉴别特种动物纤维的方法。该方法采用了液相色谱-电喷雾电离质谱 （LC-ESI-MS）作为检测手段，兼具了液相色谱仪有效分离及质谱仪强大的组分鉴定能力。Claudia等[13]通过一系列不同产地来源的动物纤维验证了该方法的普适性。张娟等[14-15]使用LC-MS/MS技术对羊毛羊绒鉴别的可能性开展了研究，找到了多个物种特异性的山羊绒，绵羊毛、绵羊绒的多肽片段，实现了定性检测，为后续定量方法的开发提供了依据。

激光解吸基质辅助飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）是另一种检测多肽的有效手段。这种新型的软电离生物质谱技术，已经在蛋白质、多肽、核酸、寡糖等生物大分子质量测定上得到了广泛应用，具有灵敏度高，准确度高，高通量，易于实现自动化等优点[16]。张娟[15]考察了尿素、二硫苏糖醇和碘乙酰胺的浓度及温度对溶解提取动物纤维角蛋白的影响，用MALDI-TOF-MS对蛋白进行测定，在一定扫描范围内找到物种特异性的质核比，建立了鉴别山羊绒、绵羊毛的方法，并通过脱磷、拉伸等羊毛的验证，确认方法的可靠、客观性。Kim等[17]用MALDI-TOF-MS分析了25个不同品种来源的山羊绒样品和7个牦牛绒样品的多肽片段，找到了物种特异的质核比作为定性鉴别的标记，并通过一系列实际样品的检测验证了该方法的准确性。

ISO 20418提供了两种多肽分析定性定量检测特种动物纤维的方法。ISO 20418-1：2018利用液相色谱-电喷雾电离质谱 （LC-ESI-MS）对特种动物角蛋白多肽进行分离检测，而ISO 20418-2：2018利用的是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）进行多肽的定性定量检测。两种方法均选择了2691、2664分别作为山羊绒，绵羊毛的特征标记。根据山羊绒、绵羊毛的特征标记（峰）进行定性。通过对已知含量的标准混合物进行测定，根据其特征峰面积或峰高，建立定量標准曲线，可实现对未知样品的定量检测。

这两种方法均需要对溶解的角蛋白进行胰蛋白酶处理，使之酶解成更易检测的多肽片段。通过对物种特性多肽短片大小的测定实现纤维的定性鉴别。不同的是第一种方法对所有的蛋白均进行了酶解处理，然后再进行分离检测，而第二种方法先使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收特定的蛋白片段后再对其进行胰酶处理[18-19]。其余方法上的差异见表1。

兩个方法的定量均需要利用已知含量的混合标样建定量标准曲线，建立起含量和物种特征的面积比之间的联系，从而实现定量检测。对MALDI-TOF-MS多肽分析法进行了进一步的研究，该定量方法对不同品种、不同产地的山羊绒均适用。剥鳞处理，拉伸处理均对其结果无影响，但该方法检测剥色紫绒混合样时发现，山羊绒检测含量偏低，推测剥色氧化剂对多肽结构有破坏作用[20]。

2.3 存在的问题

蛋白多肽定性定量测定法，可轻松用于多种混合动物纤维的定性鉴别，特别适用于多种动物纤维混合物的定性鉴别。只要知道特征标记，即可识别其存在。若构建合适的定量模型后，也可用于3种甚至更多混合纤维的定量。但该方法的灵敏度不够高，混合低值仅能测到5%左右[19]。此外，该方法对氧化剥色的产品也不适用。

3 结 语

回顾了特种动物纤维分子生物学水平定性定量的研究历程和最新进展，对国内外现行的标准方法进行了比较分析。总的来说，DNA检测仪器设备投入低，相对比较成熟，灵敏度高，但适用的范围受限更多一些;蛋白检测适用范围广，但灵敏度不高，低含量样品无法检测。这些方法的开发和应用，是对传统检测方法的有益补充，实现了仪器检测，减少了主观因素的影响，对毛纺产品的质量监督检验、消费者合法权益的维护有重要意义。特种动物纤维的检测，尤以羊毛羊绒为代表在定量检测，到目前为止还是纤维成分鉴别的难题。综合运用显微镜法和分子生物学检测法，能得到相对准确可靠的结果。

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