基于数据挖掘和网络药理学分析中药治疗痛风的用药规律及作用机制

2022-02-13李泽宇郝二伟曹瑞林思庄培钧杨潇杜正彩侯小涛邓家刚

科学技术与工程 2022年36期

李泽宇，郝二伟，曹瑞，林思，庄培钧，杨潇，杜正彩，侯小涛，邓家刚*

(1.广西中医药大学广西中药药效研究重点实验室，南宁 530000； 2.中国-东盟传统医学研究国际合作联合实验室，南宁 530200)

痛风是指与高尿酸血症、尿酸盐沉积密切相关的代谢性疾病，在中医药理论中属于“痹证”“肢体痹”“白虎历节”等范畴，临床表现以急性和慢性痛风性关节炎为主。随着人们生活条件的改善，蛋白质、糖、脂肪等摄入量大幅提升，导致痛风在全球范围内发病率显著提高且有年轻化趋势，在中国，痛风和高尿酸血症患病率分别高达1.1%和13.3%[1-2]。痛风还易并发如高血压、糖尿病、冠心病、阿尔茨海默病等多种疾病[3-4]。痛风的病证表现以关节炎急性发作为主，并伴有剧烈的疼痛感，严重影响了患者的生活质量[5]。目前，中外治疗痛风常用药物为秋水仙碱、丙磺舒、苯溴马隆、非布司他等，但这些药物多以缓解症状为主，且副作用较大、停药后易复发[6-7]。痛风有着易破坏关节、易造成多器官器质性病变、易反复等多种恶性生物学行为，而中药具有安全性高、多靶点调节等特点。研究表明，中药可通过调控酶[如基质金属蛋白酶(MMPs)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、环氧化酶-2(COX-2)]、炎症因子[如白介素6(IL-6)及核因子κB(NF-κB)等通路发挥抗痛风作用，因此从中药中寻找能够有效治疗痛风的药物及药物组合有着较大的现实意义。

中药在防治痛风方面优势显著，现临床中已应用多种中药(如牛膝、黄柏等)及处方来有效应对痛风，但具体用药体系较为繁杂，揭示这些抗痛风中药的应用规律及具体机制的必要性及意义重大，本文基于此研究目的，首先采用数据挖掘的方法，从多种数据库中收集治疗痛风的中药处方，并应用SPSS软件对这些处方进行频次及归类分析，确定了治疗痛风的高频中药及药对，根据分析结果确定了治疗痛风的核心中药，然后以这些核心中药为分析主体，采用网络药理学方法具体分析了其重要的作用靶点及通路。

由于中药成分及其与人体相互作用的多样性和复杂性，对中药机制的阐明仍是一大难题，揭示中药的应用规律及分子作用机制，是突破中医药现代化和国际化“瓶颈”的关键[8-9]。为此，通过应用数据挖掘、网络药理学这两种新兴的中医药大数据科学分析技术，拟为中药治疗痛风的应用规律及作用机制提供一定的理论支持和思路方法，同时为临床中的中药抗痛风治疗提供借鉴与参考。

1 资料与方法

1.1 数据挖掘分析

1.1.1 数据来源

将“中药”“痛风”“痛风性关节炎”“高尿酸血症”“处方”设置为关键词，检索中国知网(CNKI) 、万方数据知识服务平台(Wangfang data) 、维普中文科技期刊数据库(VIP)、Pubmed、中国生物医学文献数据库、等数据库，拟确定中医药治疗痛风的相关文献。

1.1.2 文献纳入标准

用于治疗痛风的中药处方均为纳入标准，包括经典名方、病案分析、专家经验、个案报道等，且处方具有完整药物组成及剂量。

1.1.3 文献排除标准

处方数据不完整、重复文献、综述、无药效学验证、不属于确切治疗痛风药物等被排除。

1.1.4 文献数据处理

考虑到录入药物因炮制、别名不同而造成对药物分析的不准确，将中药的名称归一化，即将所录入中药参考《中国药典》[10]《中药学》[11]进行规范化处理，如将薏米替换成薏苡仁，山萸肉替换成山茱萸，川牛膝、怀牛膝替换成牛膝等。

根据纳入标准与排除标准，将筛选得到的处方药物导入Excel表格中进行药物频次统计分析，应用SPSS Modeler18 软件及SPSS Statistics 24 统计软件进行关联规则分析、复杂网络分析及聚类分析。

1.1.5 治疗痛风核心药物筛选

根据数据挖掘分析结果，将高支持度、高置信度处方结合处方中出现的高频次单味药来确定治疗痛风的核心药物。

1.2 网络药理学分析

1.2.1 高频次中药活性化合物的确定

在TCMSP数据库搜集数据挖掘确定的高频次中药的化学成分，根据口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug like property，DL)≥0.18筛选得到相应活性化合物。

1.2.2 高频次中药与疾病靶点的确定

收集TCMSP中高频次中药活性化合物靶点，并从 Genecards 数据库获取“痛风”的相关靶点，用Uniprot数据库将这些靶点进行校正，删除无效及重复靶点，然后将这些活性化合物的靶点汇总，并与“痛风”的靶点取交集。

1.2.3 高频次中药治疗痛风核心靶点的确定

将高频次中药中药活性化合物与“痛风”的交集靶点导入String数据库，构建蛋白互作(protein interaction, PPI)网络，物种限定为“homo sapiens”，最低相互作用阈值设为中等“medium confidence”(0.4)，获取 PPI 信息，将数据导入Cytoscape软件中绘制 PPI 网络，分析网络拓扑参数，筛选出核心靶点蛋白。

1.2.4 高频次中药治疗痛风的生物功能富集及作用通路分析

应用Metascape数据库对高频次中药治疗痛风靶点进行生物功能富集(biological function enrichment, GO)分析，分析包括生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)分析，并利用 Bioinformatic 平台中高级气泡图进行可视化分析。信号通路分析涉及KEGG分析和共有靶点基因组表达分析。

1.2.5 “核心靶点-核心通路”药理网络的构建

将核心靶点及核心作用通路构建“核心靶点-核心通路”网络，先将核心靶点与核心通路信息输入 Excel 表格中，再将其导入 Cytoscape 3.7.2 软件中进行可视化处理。研究方法流程图如图1所示。

P表示统计量的显著性图1 研究方法流程图Fig.1 Flow chart of research method

2 结果

2.1 高频次治疗痛风中药分析

根据相关纳入标准，共收集治疗痛风处方302首，其中茯苓、黄柏、牛膝、薏苡仁、苍术、萆薢频次大于100，说明这些药物为治疗痛风的常用药物，研究这些药物治疗痛风的价值较大，频次前20的核心药物及其属性如表1所示。

表1 治疗痛风高频次中药Table 1 high frequency traditional Chinese medicine for the treatment of gout

2.2 高频治疗痛风中药处方分析

为进一步确定治疗痛风中药的核心配伍关系，通过SPSS Modeler中的 Apriori 功能对高频药物进行关联，三项关联设置支持度10%，置信度80%，得到核心药物组合7个，分析结果如表2所示。SPSS Modeler复杂网络分析如图2所示，其中药物间的线条越粗，表明其关联性越强。 SPSS Statistics聚类分析可得：黄柏、苍术；牛膝、忍冬藤；赤芍、山慈菇、秦艽；泽泻、地黄；茯苓、萆薢、威灵仙；红花、桃仁、川芎；当归、黄芪；甘草、白术、桂枝。具体聚类分析情况如图3所示。

表2 治疗痛风高频次中药关联规则分析Table 2 Analysis of association rules of high-frequency traditional Chinese medicine in the treatment of gout

图2 治疗痛风高频次中药关联规则网状图Fig.2 Network diagram of association rules of high-frequency and low-frequency traditional Chinese medicine for the treatment of gout

2.3 治疗痛风核心中药筛选

通过综合以上的高频次治疗痛风中药及中药处方分析，拟采用黄柏-苍术-牛膝、黄柏-苍术-薏苡仁、茯苓-萆薢-苍术、茯苓-萆薢-牛膝、苍术-薏苡仁-黄柏、茯苓-萆薢-薏苡仁、茯苓-威灵仙-萆薢这7大筛选出的高支持度和置信度关联处方中涉及的相关中药作为治疗痛风核心的核心中药，这也符合聚类分析的结果，共涉及茯苓、黄柏、牛膝、薏苡仁、苍术、萆薢、威灵仙，结合高频次治疗痛风中药表分析发现，根据处方筛选出的这7大中药处于高频次治疗痛风中药中的前8位，而泽泻也处于前八位中但未归于处方组合中，因此补充治疗痛风常用中药泽泻。

2.4 治疗痛风核心中药活性化合物的确定

在TCMSP数据库搜集数据挖掘确定的治疗痛风核心中药的化学成分，根据OB≥30%，DL≥0.18的筛选条件，确定了共计109个活性成分，其中茯苓15个，黄柏37个，牛膝20个，薏苡仁9个，苍术9个，萆薢2个，泽泻10个，威灵仙7个，删除重复成分后，共计95个活性成分。

2.5 治疗痛风核心中药与痛风疾病靶点的确定

将2.4节中95个活性成分导入TCMSP数据库，并经Uniprot数据库校正及删除空白无效靶点后，共确定1 158个作用靶点，去重后共计得231个靶点。从Genecards数据库筛选得到有关痛风的靶点1 541个。将中药靶点与疾病靶点取交集后，得到交集靶点82个(图4)，即这82个靶点就是这些中药发挥抗痛风功用的关键作用靶点。

图3 治疗痛风高频次中药聚类分析图Fig.3 Cluster analysis diagram of high-frequency and low-frequency traditional Chinese medicine for the treatment of gout

图4 中药与疾病靶点交集图Fig.4 intersection of traditional Chinese medicine and disease targets

2.6 治疗痛风核心中药关键靶点的确定

初步构建的PPI网络共涉及82个节点和 1 321 条边。具体靶点及拓扑参数信息如表3所示，为了找出这些核心中药抗痛风的关键靶点，首先按照中位数筛选得到44个节点和802条边的PPI网络，再按照degree大于45，中间性(betweenness)大于0.007，接近度(closeness)大于0.684的条件筛选得到含17个节点，136条边的核心靶点PPI网络，筛选流程如图5所示，以节点度值为评价参数，节点度值越大其靶点越大，连接线条颜色越深，也说明其在 PPI网络中越重要，可能在发挥生物学功能中起着重要的作用。

表3 PPI筛选核心拓扑参数Table 3 PPI screening core topology parameters

2.7 治疗痛风核心中药的GO及作用通路分析

GO富集分析结果如图6所示，生物学过程(BP)富集分析提示，细胞粘附调节、血管发育、伤害反应、对脂多糖的反应、对营养水平的反应、细胞分化的负调控在中药治疗痛风中比较重要；细胞组分(CC)富集分析表明，靶点的产物可能主要在膜筏、膜侧、囊腔、细胞外基质、细胞质核周区等部位；分子功能(MF)富集分析表明，靶点可能是通过受体-配体活性、转录因子结合、蛋白质同源二聚化活性、蛋白激酶活性等发挥作用。

作用通路分析结果如图7所示，分析显示其作用通路包括环境信息处理、细胞过程、组织系统、人类疾病四大类，也说明中药治疗痛风作用靶点主要富集在癌症、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号、IL-17信号、MAPK信号、细胞因子-细胞因子受体相互作用、癌症中的转录失调等通路，提示这些经典通路可能在中药治疗痛风作用中发挥着重要作用。

为进一步分析其基因组对通路的调控情况，中药治疗痛风全基因组表达分析如图8所示，该分析具体涉及的调节过程包括白细胞介素- 4、白细胞介素-10、白细胞介素-13、免疫系统中的细胞因子信号转导、基质金属蛋白酶的激活、基因转录途径等，这表明中药抗痛风作用的发挥与这些生物活性行为密切相关。

2.8 治疗痛风核心中药“核心靶点-核心通路”网络构建

为进一步直观分析治疗痛风核心中药的作用靶点和通路之间的关系，将PPI分析确定的17个核心靶点及通路分析确定的20条核心通路进行“核心靶点-核心通路”网络的构建，去除无连接效应的2条核心通路后，绘制结果如图9所示，节点字体、形状越大，颜色越深，表明该节点与其他节点作用关系越密切，在中药治疗痛风中发挥的作用可能越重要。

3 讨论

《景岳全书》中记载痛风是由于“外湿侵袭”及“饮食不节”引起的内生湿热所致，风、寒、湿、热、瘀为痛风急性发作的病因病机，痛风按照证候分类可分为湿热蕴结型、瘀热阻滞型、痰浊阻滞型、肝肾阴虚型[12]，而中医药能够更好地把握痛风的病因病机，从而分证论治，在治疗痛风、降尿酸、改善关节功能方面更具优势[13]。首先从文献中收集到治疗痛风的方剂处方302首，分析发现其中的高频药物包括利水渗湿药(茯苓、薏苡仁、萆薢、泽泻、车前子、虎杖)，清热药(黄柏、赤芍、忍冬藤)，活血化瘀药(牛膝、红花)，化湿药(苍术)，祛风湿药(威灵仙、秦艽、防己)，补虚药(甘草、当归、白术)，泻下药(大黄)，解表药(桂枝)。根据以上治疗痛风药物的属性佐证了痛风的风、寒、湿、热、瘀的病机特点，且根据分析可得出中药治疗痛风应以祛湿利水、清热活血为主，泻下、解表、补虚为辅。

P表示统计量的显著性图6 GO分析气泡图Fig.6 Go analysis bubble diagram

图7 KEGG通路功能分析图Fig.7 KEGG channel function analysis diagram

Muscle contraction为肌肉收缩；Digestion and absorption为消化和吸收；Developmental Biology为发育生物学；Neuronal System为神经元系统；Immune System为免疫系统；Circadian Clock为昼夜钟；Signal Transduction为信号转导；Hemostasis为止血；Metabolism of RNA为RNA代谢；Metabolism为新陈代谢；Disease为病；Chromatin organization为染色质组织；DNA Repair为DNA修复；DNA Replication为DNA复制；Transport of small molecules为小分子的运输；Sensory Perception为感官知觉；Cell Cycle为细胞周期；Programmed Cell Death为程序性细胞死亡；Reproduction为生殖；Cellular responses to stimuli为细胞对刺激的反应；Organelle biogenesis and maintenance为器官生物发生和维持；Autophagy为自噬；Protein localization为蛋白质定位；Extracellular matrix organization为细胞外基质组织；Metabolism of proteins为蛋白质代谢；Vesicle-mediated transport为囊泡介导的运输；Cell-Cell communication为Cell-Cell通信；黄色部分表示在该功能模块呈现过表达状态；灰色部分表示表达状态不显著图8 中药治疗痛风全基因组表达分析图Fig.8 Whole genome expression analysis of gout treated with traditional Chinese medicine

根据数据挖掘中的关联规则分析，筛选出了高频次中药及药对，根据得到的中药及方剂配伍结果，确定了治疗痛风的主要中药组合为黄柏、苍术；牛膝、忍冬藤；赤芍、山慈菇、秦艽；泽泻、地黄；茯苓、萆薢、威灵仙；红花、桃仁、川芎；当归、黄芪；甘草、白术、桂枝，且筛选得到了茯苓、黄柏、牛膝、薏苡仁、苍术、萆薢、威灵仙、泽泻为治疗痛风的核心药物，因此以这些中药为研究主体，分析了其治疗痛风的作用机制。研究表明，黄嘌呤氧化酶(XOD)是尿酸代谢的重要调控酶，能够催化体内尿酸的形成，从而导致尿酸浓度升高，引起痛风的发作，XOD也能通过级联反应诱导大量活性氧的生成，而这些活性氧与炎症、癌症、细胞损伤等有关[14]。此外，环氧化酶(COX)、基质金属蛋白酶(MMPs)、炎症因子也影响着痛风的发展进程。研究证实，茯苓提取物能促进尿酸排泄，有效降低血尿酸水平，且对XOD有显著的抑制作用，能够通过调节尿酸转运蛋白来促进尿酸的排出[15]。茯苓多糖抑制急、慢性炎症效果显著，能够降低TNF-α(巨噬细胞产生的坏死因子)、IL-1β(IL-1为白细胞介素-1，其存在形式有IL-α、IL-β)、IL-6水平，抑制JAK2/STAT3通路[16-17]。黄柏提取物也能显著降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平，并降低肝脏XOD活性[18-19]，其也可抑制炎症因子TNF-2、IL-2表达[20]。牛膝擅于强筋骨，能够“引药下行”，其含有的牛膝总皂苷能够降低尿酸水平，从而发挥抗痛风作用[21-22]。薏苡仁具有舒筋除痹之功，《神农本草经》中记载其可除“风湿痹”，治“筋急拘挛”。薏苡仁能够通过降低血管通透性发挥抗炎作用，其也能够调控IKK/NF-κB信号通路，降低多种炎症因子的分泌水平[23-24]。此外，薏苡仁也可使COX含量和抗氧化酶活性显著降低，说明其可通过抑制促炎性因子表达、抗氧化来发挥治疗痛风性关节炎的作用[25]。有研究证实以苍术为君药的苍术白虎汤可以降低高尿酸血症小鼠的血尿酸水平，这可能与其降低 XOD 活性有关[26]，苍术也能显著抑制IL-6、IL-8、TNF-α、COX代谢产物前列腺素E2的过度表达[27-28]。萆薢能显著改善痛风性关节炎的疼痛和肿胀情况，萆薢总皂苷也可有效抑制尿酸盐转运蛋白的表达，从而减少尿酸的重吸收，促进尿酸排泄[29-30]，这可能与其抑制XOD活性，下调大鼠肾脏尿酸转运体1(URAT1)表达,上调有机阴离子转运体1 (OAT1) 、有机阴离子转运体3 (OAT3) 的表达有关[31-32]。威灵仙祛湿止痛效佳，为治疗痹症的要药，其能够显著降低血清尿酸、减少尿酸盐结晶沉积和炎性细胞浸润[33]，这可能与其抑制COX-2活性，抑制TNF-α炎症因子有关[34]。泽泻利水渗湿作用较强，能够抑制COX-2、1L-1β 和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性和NF-κB表达，上调Net2炎症基因表达，从而减少炎症因子的产生来发挥抗炎作用[35-38]，这也是其治疗痛风性关节炎的依据所在。因此，这些中药用作治疗痛风都有着一定的理论基础。

Pathways in cancer为癌症的途径；AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路；IL-17 signaling pathway为IL-17信号通路；MAPK signaling pathway为MAPK信号通路；Cytokine-cytokine receptor interaction为细胞因子-细胞因子受体相互作用；Transcriptional misregulation in cancer为癌症中的转录失调；Longevity regulating pathway为长寿调节途径；Allograft rejection为同种异体移植排斥反应；Platinum drug resistance为铂耐药性；Dopaminergic synapse为多巴胺能突触；Ovarian steroidogenesis为卵巢类固醇生成；drug metabolism为药物代谢；Thyroid cancer为甲状腺癌；TGF-beta signaling pathway为TGF-β信号通路；Complement and coagulation cascades为补体和凝血级联；Leukocyte transendothelial migration为白细胞经内皮细胞迁移；Mitophagy-animal为线粒体吞噬-动物；PPAR signaling pathway为PPAR信号通路；Adherens junction为粘合连接；Antigen processing and presentation为抗原处理和呈递图9 中药治疗痛风“核心靶点-核心通路”网络图Fig.9 Network diagram of “core target core pathway” of traditional Chinese medicine in the treatment of gout

PPI分析结果显示，这些抗痛风核心中药的关键作用靶点为AKT1、TNF、IL6、VEGFA、TP53、IL1B、PPARG、EGF、PTGS2(COX-2)、MMP9等，痛风多以关节炎为表现形式，研究证明这些作用靶点能够有效调控炎症的表达，此外慢性炎症也能够诱导癌症的发生，这些靶点也能够影响癌症通路的表达。AKT1主要参与细胞进程，能够调控细胞生长和存活，在肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移等多种生物过程中发挥作用，其能够通过自身磷酸化可以调节多种包括VEGF，MAPK，NF-κB在内的下游通路从而调控炎症作用，如其能够激活炎症因子NF-κB的核转位过程等[39-40]。TNF可作为免疫系统的关键靶点，其自身也是一种重要的炎性因子，也可促进IL-6，IL-10等细胞因子的产生，从而进一步加重炎症反应[41]，其也可调控NF-κB途径，促进IL-6、IL-1β、PTGS2等下游炎症因子的分泌[42]。IL6为经典的炎症基因，能够直接激活血管内皮细胞和炎症细胞，下调IL-6的表达能够有效抑制炎症反应[43]，现代研究多通过测量血清中的IL-6表达水平来评估机体炎症及组织受损的程度大小[44]，且IL-6与痛风石的形成密切相关，在痛风性关节炎急性发作期呈现过表达状态，能引起炎症急性期反应[45-46]，IL-1β对痛风的发病过程有着一定的调控作用，能够增强巨噬细胞与粒细胞的活性，促进 IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌，使软骨细胞降解加速，从而引发关节功能受损[47-48]。VEGFA是刺激血管生成的主要因子,其能够诱导内皮细胞增殖，抑制细胞凋亡，其也能够通过磷酸化过程激活PI3K通路，在多数肿瘤中表达上调，其也与炎症的表达有关，能够增加血管通透性，刺激炎症的形成和发展[49-50]。TP53为强效抑癌基因，可参与细胞周期调控，能够通过控制细胞周期所需的基因来调控细胞分裂，也有研究证实了TP53基因突变会促使恶性肿瘤的发生[51]。根据这些治疗痛风核心中药的关键作用靶点可知，其抗痛风作用的发挥依赖于其对多种炎症通路的调节，这与这些中药单味药抗痛风的作用机制相印证。分析结果也表明，COX、MMP、炎症因子、AKT通路等也是这些抗痛风中药发挥作用的核心影响因素。由此可知痛风可通过多种炎症的“级联”反应导致关节炎的发作，而这些核心中药能够有效抑制炎症的这一“级联”效应。

根据GO和作用通路的分析结果可知，治疗痛风中药的这些靶点作用的发挥主要影响细胞粘附调节、血管发育、损伤反应等生物学过程，通过作用在膜筏、膜侧、囊腔等部位发挥受体-配体活性、转录因子结合、蛋白质同源二聚化活性、蛋白激酶活性等分子功能。这些作用靶点主要影响癌症、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号、IL-17信号、MAPK信号、细胞因子-细胞因子受体相互作用、癌症中的转录失调等通路，这些通路涉及到环境信息处理、细胞过程、组织系统和人类疾病方面。全基因组表达分析显示，中药抗痛风作用的发挥与其调节多种炎症白细胞介素密切相关，此外，其还对免疫系统中的细胞因子信号转导、基质金属蛋白酶的激活、基因转录途径等过程产生影响。

网络药理学以系统生物学和生物网络平衡为基础，通过构建成分-靶点-通路之间的网络关系来探讨药物治疗疾病的作用机制，更符合中医药的整体观[52-53]。中医药数据挖掘是依托于现代数据软件，主要用于系统分析传统中医药理论及临床处方应用规律的技术。这些现代新兴技术的发展为中药用药规律及作用机制的合理解释提供了科学的方法，这也契合了中药“多靶点-多通路”调节的特点。综上分析，痛风多以关节炎急性发作为表征，中药治疗痛风的作用机制主要依赖于对多种酶(XOD、COX、MMPs)及多种炎症因子、炎症通路的调控，其作用的这些蛋白与通路也多与免疫调节及癌症发展有关，而免疫功能与炎症的发展进程悉悉相关，慢性炎症也是多种癌症产生的诱因，因此这些中药也可能通过调节免疫功能及调控癌症相关通路来延缓痛风进程及痛风病变。通过梳理分析中药治疗痛风的相关机制，以期为痛风的深入研究以及痛风治疗的合理用药提供一定的借鉴意义。