基于非靶向代谢组学鉴别酿造白酒与勾兑酒

◎ 包塔娜，杨 洋，王柏辉

（鄂尔多斯市检验检测中心，内蒙古 鄂尔多斯 017000）

我国传统工艺酿造的白酒，历史悠久、香型众多、口味各异。清香型白酒因其口感清香纯正、口味柔和、余味净爽等风味特征受到消费者青睐。伴随着精密分析仪器的发展，色谱、光谱、质谱等技术已被广泛应用于白酒风味物质、香型、年份酒以及真假酒的鉴别中[1]。卓俊纳等[2]利用电感耦合等离子体质谱法技术结合化学计量学鉴别不同品牌酱香型白酒，研究表明，Na、Ca、Al、K 等元素是造成不同品牌酱香型白酒差异性的主要无机元素。莫新良等[3]基于顶空固相微萃取结合气质联用技术对不同甜香风味特征酱香型白酒挥发性风味物质进行剖析，共鉴定出68 种风味物质，包括酯类27 种、醇类12 种、醛酮类10 种、酸类3 种、芳香族化合物10 种和萜烯类物质6 种。卓俊纳等[4]基于气相色谱-四极杆飞行时间质谱法结合化学计量学建立3 种白酒（浓香型、酱香型和清香型）的3 种判别模型，研究表明偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）模型的区分效果最好，同时指出己酸乙酯、乳酸乙酯等9 种物质是区分不同香型白酒风味差异的主要物质。CAJKA 等[5]基于高分辨质谱和实时检测技术分析啤酒中挥发性风味物质，再利用偏最小二乘判别分析法建立判别模型，该模型的鉴别准确度能达到100%，该判别模型对于啤酒产品的真伪鉴别具有较高的参考价值。

非靶向代谢组学技术是以无偏向的方式分析寻找尽可能多的组分，再通过统计学方法寻找能够反映组间差异的特征化合物，从而对不同个体之间的差异作出判别，已被广泛应用于食品成分分析、食品掺假鉴定、品质鉴别以及食品产地溯源等方面。JIANG等[6]利用代谢组学技术分析了不同品种荔枝果肉中多酚类代谢物的差异，试验结果表明，共鉴定出8 类126 种多酚代谢物，并推断出荔枝果肉中主要多酚代谢产物为黄酮类、黄酮醇类、羟基肉桂酰类和儿茶素类。YE 等[7]基于非靶向代谢组学技术分析不同地区绿茶中挥发性风味物质，结合主成分分析对绿茶产地进行鉴别。结果表明，不同产地来源的绿茶中挥发性物质的含量差异显著，可建立用于绿茶产地溯源的方法。DE-FLAVIIS 等[8]采用非靶向代谢组学技术对6 个地区小麦风味品质进行检测研究，共得到158 种挥发性风味成分，通过化学计量学方法对不同产地的小麦进行分类，筛选出各产地最具特征性的挥发性风味成分，为探索产地区域对小麦风味品质的影响提供了理论依据。

本文利用超高效液相色谱-飞行时间质谱技术探究酿造白酒和勾兑酒的特征标记物质，结合化学计量学建立OPLS-DA 判别模型，可为白酒鉴别和品质评定提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市场采购3 种酿造白酒（编号为BL1、BL2和BL3）和3 种勾兑酒（编号LFL1、LFL2和LFL3）。

甲酸（质谱纯）、甲醇、甲酸铵（色谱纯），美国Fisher 公司。

1.2 仪器与设备

Exion 20AD 型超高效液相色谱仪和Xevo G2-XS型高分辨四极杆飞行时间串联液质联用仪（美国Waters 公司）；Sorvall Legend Micro 17R 型离心机（美国赛默飞有限公司）；艾科普超纯水机A3S-05-05-CE（美国Millipore 公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

6 个白酒样品分别取5 mL，在3 000 g、25 ℃条件离心10 min，取上清液过0.22 μm 微孔滤膜，收集过滤后样品于进样瓶中，4 ℃保存待测。

1.3.2 色谱条件

Waters T3 液相色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温：40 ℃；流动相：A- 水（含0.1% 甲酸）、B- 乙 腈（含0.1% 甲 酸）；流 速：0.35 mL·min-1；进样体积：2 μL。梯度洗脱：0 ～2.5 min，95% A；2.5 ～4.0 min，70% A；4.0 ～9.0 min，50% A；9.0 ～11.0 min，20% A；11.0 ～14.0 min，0% A；14.0 ～15.0 min，0% A；15.0 ～15.1 min，95% A；15.1 ～16.0 min，95% A。

1.3.3 质谱条件

离子源：ESI；电离模式：正离子模式；气体温度：320 ℃；保护气温度：350 ℃；干燥器流速：7.5 L·min-1；保护气流速：12 L·min-1；喷雾气压：35 psi（145 psi=1×106Pa）；离子源毛细管电压：4 000 V；喷嘴压力：1 000 V；MS-TOF 毛细管电压：175 V；一级质谱质量扫描范围（m/z）：100 ～3 000。

1.4 数据处理

下机数据通过Abf Converter 软件转换为.ABF 数据格式，再利用MS-DIAL 软件进行峰检测和识别、反卷积、定性分析等一系列处理，然后基于HMDA 和MASS BANK 数据库对所检测到物质进行定性分析，并进行归一化处理得到数据。通过SIMCA 软件分析数据，以OPLS-DA 模型第一主成分的VIP值＞1，T检验返回的P值＜0.05 为标准，筛选酿造白酒和勾兑酒的差异代谢物，并计算出两组间差异代谢物的变化倍数（Fold Change，FC），即勾兑酒与酿造白酒中差异代谢物的比值。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 OPLS-DA 分析

非靶向代谢组学分析得到大量的多维数据，为探究数据中存在的潜在规律，需要借助一系列的多元统计分析方法进行降维处理和分析。本实验采用SIMCA软件对所有白酒样本进行有监督OPLS-DA 分析。由图1 可知，酿造白酒和勾兑酒能较好的区分开，各组聚类趋势较为明显。

图1 白酒样本的OPLS-DA 分析图

2.2 发酵酒与勾兑酒代谢物差异分析

由表1 可知，两种类型的白酒中化合物含量表达差异明显，可作为区别其他类型白酒的重要标志物。本文白酒样品中共鉴定到46 种风味化合物，最终鉴定到酿造白酒与勾兑酒间的差异代谢物共15 种。其中，6 种化合物（FC值＞1）是勾兑酒的标记物，9 种化合物（FC值＜1）是酿造白酒的标记物。次黄嘌呤（Hypoxanthine）在勾兑酒中表达差异明显，4-甲基戊酸（4-Methylvaleric acid）和羟基丁二酸（Hydroxysuberic acid）在酿造白酒中表达差异明显，可分别作为两种白酒的鉴定标志物。

表1 酿造白酒与勾兑酒的代谢物差异分析表

3 结论

本论文基于非靶向代谢组学技术对酿造白酒和勾兑酒的风味化合物进行筛查分析，利用组学思维对两种类型的白酒进行鉴别分析。白酒样品中总共鉴定出46 种风味化合物，两种类型白酒中差异化合物15种。其中，酿造白酒中4-甲基戊酸和羟基丁二酸为主要标识物；而勾兑酒中次黄嘌呤为主要标识物。通过OPLS-DA 分析能够很好地区分酿造白酒和勾兑酒。因此，依据不同酒型的风味特征，综合应用代谢组学技术结合化学计量学方法，建立标准化白酒产品真实性鉴别平台是检测机构的研究发展方向。