哮喘易感基因多态性与支气管哮喘患儿的IgE水平及嗜酸性粒细胞水平关系的研究

张小宁 张向峰 张志英 靳秀红

（郑州大学附属儿童医院，河南省儿童医院，郑州儿童医院，河南 郑州 450003）

支气管哮喘是一种与变态反应相关的呼吸系统疾病，与多基因遗传有关，儿童中常见，严重威胁儿童的身体健康。有研究发现白细胞介素-13（IL-13）基因的rs20541位点、IL-4基因的rs2243250位点、β2肾上腺素受体（ADRB2）基因的rs1042713位点、免疫球蛋白E（IgE）高亲和力受体1β（FCER1B）基因的rs569108位点，细胞色素P450家族3亚家族A肽5（CYP3A5）基因的rs776746位点、花生四烯酸5脂氧合酶（ALOX5）基因的rs2115819位点、糖皮质激素诱导转录因子1（GLCCI1）基因的rs37973位点、IgE低亲和力受体II（FCER2）基因的rs28364072位点、白三烯C4合成酶（LTC4S）基因的rs730012位点、腺苷酸环化酶9（ADCY9）基因的rs2230739位点、促肾上腺皮质素释放激素受体2（CRHR2）基因的rs7793837位点、T-BOX转录因子21（TBX21）基因的rs2240017与儿童支气管哮喘的发生有关[1-5]。IgE是介导I型变态反应的主要抗体，同时也是反应支气管哮喘患儿气道炎症的重要指标，过敏原与IgE结合后诱发肥大细胞释放组胺，并产生前列腺素D2、半胱氨酸白三烯（LTC4、LTD4和LTE4）等，导致肺部炎症反应。嗜酸性粒细胞是变态反应中的重要细胞，在T淋巴细胞产生的细胞因子IL-5的作用下增殖和活化，并在气道黏膜内聚集，表达多种细胞因子受体，释放多种炎性介质，激发气道炎症反应。因此，嗜酸性粒细胞水平是反应支气管哮喘患儿气道炎症的重要指标。本研究中探讨了支气管哮喘患儿上述基因位点不同基因型与IgE水平及嗜酸性粒细胞水平的关系，报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本研究经医院伦理审查委员会审核通过。以2018年10月—2020年10月在河南省儿童医院门诊就诊的270例支气管哮喘患儿作为研究对象，其中男142例，女128例；年龄4个月～11岁，平均（35.83±26.52）月，所有患儿均依据文献[6]中的相关标准诊断为支气管哮喘，排除合并贫血、自身免疫缺陷性疾病、严重脏器功能不全及有近30 d内糖皮质激素治疗史的患儿。所有患儿家属均签署了本研究的知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 IgE水平的检测 采集外周静脉血2 mL，以EDTA抗凝，酶联免疫吸附法（ELISA）进行检测。

1.2.2 外周血嗜酸性粒细胞的检测 取外周静脉血2 mL于普通促凝管中，4 000 r/min 离心5 min，制备血清，应用全自动五分类血液分析仪进行检测。

1.2.3 基因多态性检测 采用口腔拭子核酸提取方法。采样前30 min清水漱口或清洁口腔，至采样期间勿饮食。将采样拭子小心伸入口腔左侧内腮处，不要触及牙齿或舌，上下划动采样拭子，力度以面部腮部微凸为准，以一上一下为1次，10次后，将采样拭子旋转180°，再刮10次。取出采样拭子，注意不要触及牙齿、舌头及其他任何物体，将拭子伸入装有DNA保存液的离心管（由上海解码医学检验所提供）中，在刷柄的凹陷处将多余部分折断，使刷头留在离心管中，将盖子拧紧。重复上述步骤采集右侧内腮处样本，由上海解码医学检验所采用MassARRAY®DNA质谱分析系统进行上述基因位点的基因多态性检测。Massarray飞行时间质谱方法基因分型采用iPLEX PCR反应试剂盒，96-well SpectroCHIP生物芯片，HOTSTART Taq酶，虾碱性磷酸酶（SAP酶），阳离子交换树脂（均购自美国Agena Bioscience公司）。

1.3 统计学处理 采用SPSSl7.0统计软件。正态分布的定量资料采用表示，不服从正态分布的定量资料采用中位数（四分位数间距）[M（P25,P75）]表示。每个基因位点的3种基因型间IgE水平及嗜酸性粒细胞水平的差异采用非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基因型检测结果 在270例研究对象中，以下位点均可检出3种基因型：rs20541位点检出AA、AG、GG型；rs2243250位点检出CC、CT、TT型；rs1042713位点检出AA、AG、GG型；rs569108位点检出AA、AG、GG型；rs776746位点检出CC、CT、TT型；rs2115819位点检出AA、AG、GG型；rs37973位点检出AA、AG、GG型；rs28364072位点检出AA、AG、GG型；rs730012位点检出AA、AC、CC型；rs2230739位点检出CC、CT、TT型；rs7793837位点检出AA、AT、TT型；rs2240017位点检出CC、CG、GG型。其中rs28364072位点3种基因型的飞行时间质谱图见图1。各位点基因多态性分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05）。

图1 rs28364072位点3种基因型的飞行时间质谱图

2.2 各位点不同基因型患儿间IgE水平差异rs28364072位点基因3种基因型患儿间IgE水平差异具有统计学意义（P=0.000），GG基因型患儿IgE水平高于其他2种基因型（表1）。其余位点不同基因型间IgE水平差异没有统计学意义（P＞0.05，表1）。

2.3 上述各位点基因型患儿间嗜酸性粒细胞水平差异 上述各位点基因间嗜酸性粒细胞水平差异没有统计学意义（P＞0.05，见表1）。

表1 支气管哮喘易感基因不同基因型患儿间IgE水平及嗜酸性粒细胞水平比较[M（P25, P75）]

3 讨 论

支气管哮喘是一种多基因遗传相关性疾病，有研究发现，ADRB2、GLCCI1与哮喘的严重程度和呼吸道重塑有关；FCER1B基因、IL-13基因与哮喘的发病风险有关；IL-4主要参与IgE合成与Th2细胞分化，并促进嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及肥大细胞发育。CYP3A5基因被认为可以作为发现早期阶段哮喘的血液生物标志物；ALOX5、LTC4S和孟鲁司特钠的应答相关；FCER2、GLCCI1、ADCY9、TBX21基因和吸入性糖皮质激素的应答相关；CRHR2基因与沙丁胺醇的应答相关。本研究中未发现除FCER2基因以外其他上述基因不同基因型间IgE水平有差异[1-5]。Amo等[7]研究发现，在变应性鼻炎患者中，FCER1B基因的rs569108位点变异等位基因患者较野生型患者IgE水平低，但在变应性鼻炎合并支气管哮喘的情况下，rs569108位点变异等位基因患者较野生型患者IgE水平差异无统计学意义。另一项研究发现，rs569108位点基因多态性可能影响支气管哮喘的发病风险，但在整个人群中没有发现rs569108位点基因多态性与支气管哮喘有明显的相关性[8]。本研究中rs569108位点不同基因型间IgE水平差异无统计学意义，因此，rs569108位点与IgE水平及支气管哮喘的关系还需要更大样本量作进一步研究。Bai等[1]报道了基于IL-13基因的rs20541位点、IL-4基因的rs2243250位点、ADRB2基因的rs1042713位点、FCER1B基因的rs569108位点建立了汉族儿童支气管哮喘易感基因预测模型，在这一模型基础上的支气管哮喘高危组脐血总IgE水平较低危组更高。但在本研究中上述4个位点不同基因型间IgE水平无明显差异，可能与纳入的研究对象不同有关，本研究纳入对象全部为支气管哮喘患儿。

FCER2基因位于第19号染色体，其11个外显子中的第9、10、11外显子负责编码FCER2受体与LgE结合。有研究报道FCER2基因多态性与IgE水平及支气管哮喘发作严重程度相关[9-10]。本研究中rs28364072位点GG基因型较其他两种基因型IgE水平高；这一基因型可增加支气管哮喘难控风险。一项针对支气管哮喘患儿皮质类固醇反应不良预测因素的研究发现，这种基因型儿童支气管哮喘复发和急性加重的风险较AA基因型儿童高3.3倍和3倍，肺功能差的风险比AA基因型儿童高9倍[11]。另一项关于儿童支气管哮喘的药物遗传学研究发现，FCER2基因rs28364072位点GG基因型患儿与支气管哮喘相关的住院风险增加，支气管哮喘失控风险增加，类固醇剂量增加[12]。据此推测，rs28364072位点GG基因型可能通过增加IgE水平而增加支气管哮喘难控风险。

调查表明，尽管积极使用常规抗支气管哮喘药物（包括白三烯拮抗剂、皮质类固醇、长效肾上腺素能激动剂等）治疗，但仍有高达60%的支气管哮喘患儿病情未得到很好的控制[13]。IgE是介导I型变态反应的主要抗体，同时也是反应支气管哮喘患儿气道炎症的重要指标。研究表明，IgE水平与支气管哮喘的严重程度及支气管哮喘临床症状有关[14]。IgE主要通过与高亲和力受体FCER1和低亲和力受体FCER2（CD23）这两个细胞受体的相互作用来发挥其致病作用。发生超敏反应时，IgE与FCER1结合，能够活化肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞，这些细胞分泌大量细胞因子，引起更高的气道反应性，患者出现喘息症状。IgE的低亲和力受体CD23通过向T细胞呈递变应原、调节IgE反应和增强经皮变应原迁移而导致炎症的发生[15]。CD23是Ⅱ型膜糖蛋白，它的羟基末端由C型凝集素头组成，以钙依赖性方式结合IgE。虽然CD23单体对IgE的亲和力较低，但膜结合的CD23可以形成三聚体，允许CD23对IgE形成高亲和力。有研究表明，在人气道上皮细胞表达的CD23可以通过胞吞作用，将IgE或抗原-IgE免疫复合物透过气道上皮细胞形成物理屏障在气道上皮层间转运[16]。CD23影响IgE系统和参与免疫调节，作为细胞因子和信号受体，是治疗干预的重要靶点。近年来，抗IgE疗法药物（如奥马珠单抗）被批准为新的抗炎治疗药物。奥马珠单抗通过阻断IgE与CD23受体结合，改善重症支气管哮喘患儿的哮喘症状，并且能够改善未控制支气管哮喘患儿的临床症状[13,17]。CD23在调节支气管哮喘患者IgE反应中起重要作用，而CD23是由FCER2基因编码，FCER2基因多态性筛选可能有助于预测患者对抗IgE疗法的治疗反应。

嗜酸性粒细胞参与变态反应，其被激活后聚集于气道黏膜，表达细胞因子受体，释放多种炎性介质，导致气道炎症。有研究发现，中、重度支气管哮喘患者血液中嗜酸性粒细胞计数升高可能导致病情加重[18]。但也有研究显示，支气管哮喘严重程度与嗜酸性粒细胞水平没有相关性[19]。陈玲等[20]的研究也显示，虽然与正常儿童比较，支气管哮喘患儿嗜酸性粒细胞水平升高，但其并不能反映病情的进展状况。本研究中未发现上述基因多态性与支气管哮喘患儿的嗜酸性粒细胞水平有关。嗜酸性粒细胞水平在判断支气管哮喘患儿严重程度方面的价值及与支气管哮喘基因多态性的关系方面仍需要进一步的研究。

综上，FCER2基因的rs28364072位点GG基因型支气管哮喘患儿IgE水平较其他2种基因型高，FCER2基因多态性筛选可能有助于预测患者对抗IgE疗法的治疗反应。嗜酸性粒细胞水平在判断支气管哮喘患儿严重程度方面的价值及与支气管哮喘基因多态性的关系仍需要进一步的研究。