水稻突变体的创制、鉴定及应用

刘少洋，韩 容，李志新

（长江大学农学院，湖北 荆州 434025）

水稻（Oryza sativaL.）是世界主要农作物之一，是中国播种面积最大、总产量最多和单产量最高的粮食作物。中国约67%的人口以水稻为主食［1］，其在粮食消费和生产中也一直处于主导地位。因此水稻的种质创新及其功能基因组的研究显得尤为重要。

水稻基因组较小，是单子叶禾本科植物基因组研究的模式植物，其物理图谱和遗传图谱已经构建完成［2］。水稻基因组测序于2002 年完成，为水稻基因功能的预测、鉴定、验证和改良奠定了坚实基础。研究者发现建立饱和突变体库是水稻基因功能研究中最方便最有效的方法［3］，不仅可以发掘新基因，丰富水稻的种质资源，还能为水稻的功能基因组学和育种研究提供基础材料。

1 获取突变体的方法

从人类食用水稻开始，就一直在自然诱变中筛选有利变异体。随着人类技术的提高，发现可以通过理化诱导获得新的变异体。1927 年，Muller 利用X 射线处理果蝇得到可以遗传的变异。随后物理诱变被广泛应用到农作物上，还有一种特殊的物理诱变技术——航天诱变，在20 世纪80 年代由于返回式卫星的运用而产生。化学诱变在1941 年被证实可以诱发基因突变［4］，从此理化诱变成为诱变的主流。1953 年，DNA 的双螺旋结构模型和半保留复制假说被首次提出后，现代分子生物学开始进入飞速发展的时期。1972 年，转基因技术首次在大肠杆菌中取得成功［5］。1983 年，转基因烟草问世［6］。转基因技术的发展，衍生出一种构建突变体的方法——插入突变。插入突变是将外源基因随机导入到受体基因组中，阻碍或干扰插入位点基因的表达，从而产生突变的方法。由于插入突变是随机导入的，会造成很多不确定性，为了解决这一问题，基因编辑技术CRISPR/Cas 系统应运而生。2013 年发现的CRISPR/Cas9 系统是目前最广泛和最受欢迎的编辑技术，可以比较精确地对受体基因组的目的基因进行定向修饰。获取突变体的几种常见方法以及优缺点描述如下。

1.1 自然诱变

自然诱变也称自发突变，是指在自然条件下DNA 复制、转录修复时偶尔出现碱基互补配对错误产生的突变。自从驯化植物开始，人类就有意或无意地对其进行筛选和利用，自然诱变加上人工选择对水稻的进化起到了重要作用。虽然自发突变频率很低，但其所产生的变异体有时会产生“革命性”的效果。1956 年，广西壮族自治区容县发现并育成了水稻矮杆品种矮仔占，1957 年，在广东省发现了水稻自发突变个体矮脚南特，以及中国台湾省的野生型水稻低脚乌尖等。这些变异的矮杆水稻产量大幅度提升，对中国水稻育种史产生了重大而深远的影响，被称为水稻的“第一次绿色革命”，具有里程碑式的意义。2002 年，图位克隆出了绿色革命基因，矮杆基因sd1。sd1位于第一号染色体上，是控制水稻株高的基因，该基因使作物株高降低的同时还提高了有效穗和结实率［7］。研究者还从自发突变中克隆出了单蘖基因MOC1［8］、白叶枯病抗性基因Xa21［9］、香味基因Badh2［10］等，这些基因都广泛应用在水稻育种领域。

自然诱变容易出现重要的有益基因，但由于其突变频率低，一般为了大规模地获取水稻变异体，需要建立突变体库，还需要人工干预。

1.2 物理诱变

物理诱变最常用的方法是辐射。辐射诱发产生可以遗传的变异，如染色体重排、断裂或碱基突变导致细胞分裂异常，从而加速突变速率［11］。物理诱变操作简单，诱变频率高，但不能定向控制，有时候会出现大面积的片段缺失，有利变异频率低。物理诱变中最常用的射线是60Co-γ［12］，辐照处理的剂量一般为（300±50）Gy，一般产生较小片段缺失。国际原子能机构（IAEA）和联合国粮农组织（FAO）建立的辐射诱变突变体数据库，截至2021 年7 月，数据库中植物突变品种总数已达3 365 个（http：//mvgs.iaea.org/）。柳梦林等［11］将浙粳99 通过辐射诱变后，经过农艺性状和品质分析，共获得350 份不同类型的变异体。张莉等［13］研究分析黄华占和经60Co-γ 射线后的突变体湘辐1821 的分子差异，结果表明，突变体的SNPs 变异主要以转换为主，主要突变类型为点突变。

从辐射诱变的突变体中探索出的基因有影响水稻生育期的光周期敏感基因SE5［14］、黄绿叶基因CHLIpyl3［15］、白条纹转绿基因WSL887［16］等。

随着航天技术的发展，出现了新型的物理诱变方式——航天诱变，它属于辐射诱变的一种，是利用太空环境的综合作用使种子产生变异，而且有利变异较多的育种技术。中国从1987 年开始研究太空育种，至今已经取得显著进展，并且居于世界领先水平。李金国等［17］在1992 年将籼型水稻“86-70”搭载返回式卫星进行太空诱变，选育出优质品种赣早籼47 号。王慧等［18］在1996 年运用航天育种的方法，从特籼占13 的变异体中筛选并培育出水稻国审品种华航一号，其一般产量为6.75～7.50 t/hm2，高产可超过9.00 t/hm2，适宜中国南方大部分稻区，具有良好的市场前景。陈淳等［19］将感温型水稻品种“华航31”号进行航天诱变和重离子诱变，鉴定出7 个Wx基因变异体，经过分析发现，航天诱变的生理损伤与低剂量重离子辐射相似，而变异频率与高剂量辐射相近。

1.3 化学诱变

用于种子处理的化学诱变剂主要有烷化剂（甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基乙基脲烷（NEU））、核酸碱基类似物、抗生素等，其中EMS 诱变应用最广。常用的EMS 处理浓度为0.6%～0.8%，暗处理时间为4～22 h，筛选变异植株的最佳时期为诱变M2代。EMS 诱变是单一碱基替换导致的点突变［20，21］，C/G替换成T/A，最终造成了碱基替换，所以更易获得全基因组饱和突变体库。随着近年来测序技术的发展，开发出MutMap、SIMM 等突变位点快速定位技术，使得EMS 诱变成为一种高效建立突变体库的方法［22］。陈天子等［23］利用浓度为0.5%的EMS 处理籼稻9311，在M2代筛选出抗咪唑啉酮的水稻材料，经过功能研究，发现是碱基替换导致的错义突变。倪浩凌等［24］在水稻优质品种黄华占构建的EMS 诱变突变体库中选出部分M2突变体种子，从大田中筛选出9 个穗发芽突变体。吕军等［25］利用EMS 诱导粳稻品种辽星1 号，在M2群体中筛选出叶色、株型、株高、穗型、粒型和胚乳淀粉等有明显差异的变异体336份，为水稻品种改良提供了遗传资源。

从化学诱变中定位的基因有水稻叶片衰老基因LPS1［26］、分蘖调控基因HTD3［27］、短窄旗叶基因SNFL1［28］、穗长基因PAL3［29］等。笔者所在的长江大学水稻遗传育种课题组创建突变体库主要采用物理、化学的诱变方法，目前已经用辐射诱变构建了水稻9311 的突变体库。同时在自然突变中找到一个由LR2基因调控的管壁增厚水稻突变体，LR2基因主要调控水稻茎厚、抗折力以及抗倒伏，已经申请专利（专利号：ZL201910200830.1）［30］。

1.4 体细胞克隆变异/体细胞无性系变异

植物细胞和离体组织经过脱分化、扩增和再分化3 个阶段产生再生植株的过程称为组织培养，简称组培。组培产生的再生株中会产生大量的表型变异，被称为体细胞克隆变异［31］，也称体细胞无性系变异。在组培中，常会选用胚芽鞘、花药、幼胚、成熟胚、幼穗及花药等植物组织进行培养，其中最受欢迎的是成熟胚，愈伤组织诱导率最高［32］，且流程简单方便。常用的基本培养基有N6、NB、MS、LS 等，其中N6 基本培养基在水稻中比较受欢迎，粳稻诱导率最高［33］，且利于籼稻愈伤组织的诱导［34］。1978 年Henke 等［35］在水稻再生植株培养中发现部分农艺性状产生变异，如穗长、分蘖以及株高等。随着认识的深入，了解到体细胞克隆变异的机理，主要包括染色体变异、转座子激活、DNA 甲基化、基因突变等［36］。龚志云等［36］在籼稻3037 无性繁殖过程中，发现一株长势弱且不育的变异株，经细胞学鉴定为第8 号染色体的单体，为水稻的功能基因组研究提供了一定的基础。还有研究者从水稻组织培养中筛选出了早熟、矮秆、子粒较重［37］、抗白叶枯病［38］、抗胡麻叶斑病［39］等的水稻新品系。

1.5 植物转基因技术

转基因技术主要是通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等方法将目的基因导入受体基因组中，希望可以改变其原有性状或产生新的性状。农杆菌介导法是让含有目的基因的农杆菌去侵染受体植株的伤口，从而实现外源基因与受体植株基因的整合。该方法具有成本低廉、操作简单等特点。基因枪法，又称微弹轰击技术，将外源基因包裹在金粉或钨粉表面，利用高压产生动力将其射入受体细胞整合到受体的基因组中。该方法不受基因型限制，但转化成本较高、设备昂贵、转化效率低。花粉管通道法是利用花粉在柱头上萌发形成花粉管，外源DNA 经花粉管通道进入胚囊，整合到受体植株基因组得到变异的种子。该方法操作简单、成本低廉、利于推广。转基因技术有非定向即随机插入和定向即精确插入2 种，非定向的代表有插入突变技术，定向的有基因编辑技术。

1.5.1 插入突变 插入突变是将已知的插入元件利用一定方法导入到受体植株的基因组中，希望产生具有不同表型的突变植株。主要采用的插入元件有T-DNA 和转座子（如Ac/Ds，En/Spm-dSpm）、反转座子（如Tos 17）［40］等。T-DNA 来源于根瘤农杆菌的Ti质粒，一般以单拷贝插入为主，所以一旦T-DNA 整合到受体的基因组中，后代就会符合孟德尔遗传特性且长期稳定遗传［41，42］。转座子又称跳跃基因，是一段可以自主复制并能在生物染色体间移动的DNA 序列。在水稻中，最常用的是2 个来自玉米的转座子Ac/Ds［43］和En/Spm-dSpm［44］。反转座子是通过RNA 反转录成DNA 后再进行转座的可移动元件。最常用的是Tos17，在组培过程中被激活，其再生系可以直接在田间种植，收获的种子不受转基因条款约束。

崔永祯等［45］将冷诱导基因Cbcor15a利用农杆菌介导技术侵染水稻品种日本晴，经PCR 检测，找到6 株转化苗。刘华等［46］将箭竹DNA 利用花粉管通导入到水稻中，筛选出21 个稳定遗传的变异株。李广信等［47］利用花粉管通道法将高粱的全基因组导入到水稻辽盐28 号、辽盐6 号中，获得农艺性状均有明显差异的27 个稳定株系，为水稻遗传和育种研究提供了材料。

1.5.2 基因编辑 基因编辑又称基因组工程，是一种对生物体特定基因进行编辑修饰的技术。目前运用最广的编辑技术是CRISPR/Cas9，可以相对精确地识别并修饰DNA 的特定位置。吴娴等［48］通过CRISPR/Cas9 技术改良优质大米大粒香，筛选出9 株稻瘟病抗性有明显提高且米质不变的突变体。莫天宇等［49］将水稻东农427 中耐盐负调控基因OsEIL1和OsEIL2通过CRISPR/Cas9 技术敲除后，筛选出耐盐性明显提高的突变植株。Hui 等［50］在粳稻品种宁粳1 号（NJ1）和籼稻品种黄华占（HHZ）的遗传背景下，利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术创制了新BADH2等位基因，为三系杂交稻香味改良提供重要的遗传资源。Wang 等［51］通过CRISPR/Cas9 技术对水稻中3 个减数分裂基因PAIR1、REC8、OSD1和参与受精的基因MTL进行多重编辑，发现可以通过该方法进行杂种优势的固定，解决杂交种子生产成本高的问题，具有广阔的应用前景。

对几种诱变方法进行分析比较，结果见表1。当前使用较多的是化学诱变中的EMS 诱变，操作简单且因为是单碱基导致的点突变，突变稳定快，筛选到突变体后，即可以简单地通过MutMap 技术分离出突变基因，非常有利于遗传学和育种学研究。另一种是基因编辑技术中的CRISPR/Cas9 技术，它相当于一次突变的革新，可以定点地、精准地编辑目的基因，应用前景广阔。

表1 诱变方法的优缺点比较

2 鉴定突变体的方法

2.1 表型鉴定

表型鉴定即农艺性状鉴定，主要是鉴定生育期、分蘖、株高、叶色、株型、叶型、穗型、育性、粒形、茎秆颜色及生理指标等性状的变化。表型鉴定要求变异体相对于野生型有较明显的差异，并且该变异可以稳定遗传。

任伊佳等［52］利用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变籼稻品种黄华占，在自然环境下，经过田间观察整个生育期类病斑的产生情况，最终获得一个稳定遗传的水稻类病斑突变体spl41。葛倩雯等［53］将水稻rld卷叶矮化突变体与粳稻野生型品种日本晴杂交，在成熟期通过测量剑叶叶片来筛选目的植株。林静霞等［54］利用化学诱变水稻品种Kasalath，通过对根系的长短、植株的高度、分蘖数等农艺性状表型进行分析，得到一个短根突变体ksr8，为水稻根系发育的后续研究提供了材料支持。

2.2 细胞学鉴定

细胞学鉴定主要是通过观察细胞及细胞器形态的变化来研究诱变的机理，其主要操作方法是通过电镜进行观察。刘林等［55］对来自粳稻品种宁粳6 号化学诱变突变体库的水稻白穗突变体white panicle8，用透射电镜观察幼苗期和成熟期叶片，发现大部分叶绿体发生降解，一些仅存的叶绿体中类囊体片层结构消失并出现大量嗜锇体和空泡状结构。吕军等［56］分析水稻心白突变体xb1，用电镜扫描和激光粒度仪观察淀粉粒的粒径分布情况，证明了突变体的淀粉合成过程发生了异常。尚丽娜等［57］利用透射电镜观察水稻温敏型叶片白化转绿突变体，发现不同温度下叶绿体的发育情况不同。张涛荟［58］等利用I2-KI 染色法观察野生型宁粳4 号和其突变体花粉育性，最终筛选到稳定的不育突变体，并克隆了雌雄不育基因OsFMA2。

2.3 同工酶鉴定

不同品种由于遗传物质不同，所以具有独特的特征酶带。同工酶鉴定突变体的基本原理是通过酶谱的差异来判断是否产生突变体。检测常用的同工酶有过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶。李广信等［59］将高粱DNA 导入水稻中，利用酯酶同工酶分析其亲本及后代，发现其后代显示出受体材料中没有，但与供体材料相似的酶带，表明子代获得了高粱的DNA，丰富了水稻育种材料。姜军剑等［60］对酯酶同工酶的凝胶电泳酶带进行分析，发现水稻温敏核不育与常规水稻在幼穗分化期有明显差别，为阐明温敏核不育提供了理论依据。

2.4 分子鉴定

分子鉴定是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子形态结构的变化，从分子层面挖掘变异体与野生型变化的一种方法。分子鉴定包括分子标记技术和测序技术。

分子标记技术包括蛋白质印迹法（Western blot）、RNA 印 迹 法（Northern blot）、DNA 印 迹 法（Southern blot）以及以Southern blot 和PCR 为基础衍生的RFLP、SSR 以及SNP。陈受宜等［61］将经EMS 诱导和盐胁迫产生的粳稻耐盐突变体利用水稻RFLP连锁图，用130 个标记做探针，经过RFLP 分析，在第七对染色体上找到突变位点。朴日花等［62］利用PCR 法对水稻穗退化T-DNA 突变体的插入突变体基因型进行鉴定，筛选到2 个纯和突变体。郝宏娇等［63］筛选了一个早抽穗的T-DNA 插入突变体，利用热不对称性PCR（TALL-PCR）技术研究发现，突变体的插入导致富亮氨酸类受体激酶基因功能丧失，为后续基因研究奠定了基础。宁敏等［10］利用4 个已知香味基因的分子标记，通过PCR 分子标记技术辅助选择鉴定出83 份含有香味基因的水稻材料，均为外显子缺失，且籼稻居多。陶英瑜等［64］利用CRISPR/Cas9 技术敲除水稻品种日本晴中的OsABI5基因后，通过PCR 技术和Western blot 筛选得到阳性突变株，为调控水稻种子萌发提供了理论基础。

随着测序成本的降低，对变异体材料直接进行序列分析成为可能。现在的EMS 诱变普遍采用MutMap 技术来检测突变位点。Kim 等［65］利用TILLING 技术处理日本晴，暂定了37 个突变体，后通过Sanger 测序证实了6 个突变体，其中有一个突变体与野生型的支链淀粉长度有显著差别。Cao 等［66］利用EMS 对籼稻品种9311 进行诱变，通过MutMap 和RNA-seq 技术鉴定并分析了突变体lcd1与低镉积累表型相关的候选SNP 位点及其转录组变化。Wang等［67］利用改良的MutMap 方法鉴定了水稻突变体wb1，得知其胚乳发育是由调控因子WB1来调控的，为培育新的品质性状提供种质基础。

3 展望

本研究介绍了变异体的5 种创制方法和4 种鉴定方法。创造丰富的水稻突变体是遗传学和育种学研究的重要基石，需要多种方法相互结合，单一方法诱导突变体，其变异范围和类型存在一定的局限。为了提高水稻的突变频率、扩大变异率，现在更多的是向多种方法结合的方向发展，比如在组织培养的过程中施加理化诱变的因素使其产生更多的变异，基因编辑也不仅限于单个基因，也朝着多基因及基因组编辑的方向发展，将会有更丰富的变异体材料出现。