河南方城产裕丹参中酮类成分的周期变化规律研究

赵丽娜，王一硕，张振凌

(1.郑州铁路职业技术学院，郑州 451460；2.河南中医药大学，郑州 450008)

丹参作为一味中药，为历代医家所推崇，“一味丹参散，功同四物汤”，指出其在治疗心血管疾病中具有重要的地位。丹参为唇形科植物丹参(SalviamiltiorrhizaBge)的干燥根及根茎，其主要功效为活血化瘀，调经止痛，清心除烦，凉血消痈[1]。裕丹参，俗名血参，是传统中药材丹参的一种，其品质优异，疗效显著，古时因产于河南南阳裕州(今为河南南阳方城县)而驰名。方城县地理位置特殊，正处于桐柏山脉与伏牛山脉、淮河流域与长江流域、北亚热带与南暖温带的分界线上，气候环境独特，孕育出的裕丹参具有枝条粗壮、颜色紫红、品质优、疗效好等特点，被医圣张仲景称为“丹参之首”。丹参的有效成分包括脂溶性成分(二萜醌类)和水溶性成分(酚酸类)，均具有一定的生理活性[2]。2020版《中国药典》丹参项下脂溶性成分以丹参酮类成分作为质控指标[1]，包括丹参酮ⅡA、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ，因此本文以丹参酮类成分作为丹参脂溶性成分的代表研究其动态积累规律，为确定裕丹参最佳采收日期和产地加工方法，制定裕丹参药材种植标准操作规程提供科学依据。

1 仪器、试剂与药材

1.1 仪器

LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津)，Agilent SB-C18(4.6×250mm)；BS210S型万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；AUW120D分析天平(日本岛津)；DHG—9076A型恒温鼓风干燥箱(上海屹尧科技有限公司)；KQ-500DV型超声波清洗器(世安科技股份有限公司)；SC-1000Y高速粉碎机(上海尚层科技有限公司)。

1.2 试剂

本实验所采用的实验用水为二次去离子水，具体实验试剂信息见下表1。

表1 试剂信息

1.3 药材

本实验所用裕丹参样品来源于河南省南阳市方城县华丰中药材有限公司裕丹参种植基地，经过河南中医药大学中药学科专家鉴定为双子叶植物唇形科鼠尾草属植物丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根茎。

2 实验方法与供试品溶液的制备

2.1 色谱条件

本实验采用C18色谱柱；柱温为20℃，检测波长为270 nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.02%磷酸溶液，按下表2中色谱条件的规定进行梯度洗脱。

表2 色谱条件

2.2 对照品溶液的制备

精密称定丹参酮IIA对照品0.2mg，置10mL棕色量瓶中，加甲醇制成每1mL含20μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

将丹参样品粉末粉碎后过三号筛，精密称定0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入50mL甲醇，密闭，称定重量后，超声处理(功率140W，频率42kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.4 线性关系的考察

精密吸取上述对照品贮备溶液4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL，加入高效液相色谱仪自动进样系统，依次进样，测定峰面积。以色谱峰面积为纵坐标(Y)，以进样体积(μL)为横坐标(X)，进行回归分析，回归方程Y=114825X-59067，R2=0.9993。结果表明丹参酮ⅡA在4～14 μL范围内线性关系良好。

表3 丹参酮IIA标准曲线制备

图1 丹参酮IIA的标准曲线

2.5 稳定性试验

精密吸取供试品溶液10μL，于0、2、4、8、16h加入高效液相色谱仪自动进样系统，自动进样，测定丹参酮ⅡA的含量，RSD为0.92%，表示溶液在16h内供试品溶液保持稳定。

2.6 重复性

取同一批次样品5份，按照上述样品的制备方法的方法制备溶液，进样量为10μL，加入高效液相色谱仪自动进样系统，自动进样，测定丹参酮ⅡA的含量，RSD为1.02%，结果表明重复性较好。

2.7 中间精密度试验

取同一样品，在不同时间，不同分析人员进行样品测定，进样量为10μL，加入高效液相色谱仪自动进样系统，自动进样，测定丹参酮ⅡA的含量，RSD为0.75%，结果表明精密度较好。

2.8 样品测定

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，加入高效液相色谱仪自动进样系统，进行自动进样，测定结果以丹参酮ⅡA对照品为参照，以其相应的峰为S峰，计算隐丹参酮、丹参酮Ⅰ的相对保留时间，相对保留时间及校正因子见表4，其相对保留时间应在规定值的±5%以内。以丹参酮ⅡA的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的含量。

表4 相对保留时间及校正因子

3 不同产地加工方法对丹参中酮类成分的影响

3.1 样品处理

参考有关文献记载[3-4]，将同一批新鲜丹参药材除去泥沙，剪掉须根和茎叶，混匀，分成等份进行了如下处理晒干、阴干、鲜切、发汗处理。具体处理方法见表5。

表5 不同干燥方法

3.2 含量测定

参照“2实验方法”项下色谱条件、供试品溶液的制备及样品测定，对不同产地加工方法处理的丹参各供试品溶液，按照色谱条件，测定供试药材中丹参酮ⅡA的含量，从而根据校正因子计算出隐丹参酮、丹参酮Ⅰ的含量，再计算出丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的总量，结果见表6。

表6 不同加工方法丹参酮类成分含量

3.3 结果分析

实验结果表明，丹参酮ⅡA在晒干法处理中含量偏低。在阴干、鲜切、直接发汗等无光照条件下含量较高，这是由于丹参酮ⅡA的化学性质不稳定，遇光容易分解。实验证明丹参的最适宜炮制加工工艺应以阴干法为主，但是缺点也很明显，就是所耗费的时间较长，因此本次实验采用低温烘干法处理鲜丹参药材。

4 不同生长时间对丹参中酮类成分的影响

4.1 样品采集

本实验所用裕丹参样品来源于河南省南阳市方城县华丰中药材有限公司裕丹参种植基地，经过河南中医药大学中药学科专家鉴定为双子叶植物唇形科鼠尾草属植物丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根茎。从丹参育苗开始计算生长时间，分别于8月龄、9月龄、10月龄、11月龄、一年、一年半、二年、二年半采集丹参药材样品。

4.2 样品处理

根据“3 不同产地加工方法对丹参中酮类成分的影响”优选的实验条件，将采集的新鲜丹参药材分别经低温烘干至含水量在30%时，抢水洗后直接切厚片，低温烘干。

4.3 含量测定

参照“2 实验方法”项下色谱条件、供试品溶液的制备及样品测定，对不同生长时间采集处理的丹参各供试品溶液，按照色谱条件，测定供试药材中丹参酮ⅡA的含量，从而根据校正因子计算出隐丹参酮、丹参酮Ⅰ的含量，再计算出丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的总量，结果见表7，图2。

表7 不同采收日期裕丹参中酮类成分的含量

图2 不同生长时期裕丹参中酮类成分含量变化趋势

5 讨论

本实验将丹参药材分别采用晒干、阴干、鲜切、直接发汗进行相应的加工处理，通过测定丹参酮类成分含量比较不同产地加工方法对丹参有效成分产生的影响。经本实验的数据比较，丹参酮ⅡA在阴干、鲜切、直接发汗等无光照条件下含量较高，这是由于丹参酮ⅡA是丹参中主要的脂溶性有效成分，但性质不稳定，在高温或光照条件下易分解[5]，丹参产地加工工艺应以阴干法为主，但是缺点也很明显，就是所耗费的时间较长，建议采用低温烘干法加工丹参药材。丹参药材抢水洗可较好的除去表面泥土，保证药材的洁净度，减少有害重金属的污染。抢水洗对丹参酮类成分影响不大，但对水溶性成分如酚酸类有一定的降低作用。有些文献记载，加工丹参时，除去泥土，但忌用水洗。中国药典中也没有规定泥土应如何除去。根据产地加工多年的经验主要采取干燥后抖掉泥土，也有将药材集中堆放，采用淋水除去表面泥土，但这种方法显然很影响质量，严重者会导致发霉变质。因此，关于丹参的产地加工、除去泥土的方法等还有待进一步考察研究，本实验根据传统经验采用抢水法除去泥沙后，切片，烘干，并采用低温烘干机，控制温度在30～40℃。使用烘干机不仅可以快速使药材烘干，而且温度比较可控且均一，可有效控制药材的质量，故而避免了一般烘房控温时因受人为因素影响较多而引起药材质量的变化。实验中所使用的丹参药材是河南省南阳市栽培的药材，已经过多次的良种选育，质量优异，是目前市场上销售的主要丹参品种之一。根据《中国药典》(2020版)规定，丹参按干燥品计算，含丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的总量不得少于0.25%。

本实验结果表明裕丹参中酮类成分的总量在1%左右，是药典含量的4倍，也进一步证明了河南产裕丹参药材的品质。通过对不同生长时期裕丹参中酮类成分含量的分析，结果表明裕丹参中丹参酮类成分在不同生长时期，含量变化较大，两者均在生长一年半后，每年11月份达含量的最高峰。因此，在确定丹参的采收期时必须综合考虑，在丹参规模化产地加工及生产过程中，尤其在试行趁鲜切制加工过程中，必须进行规范操作，制定严格的GAP管理制度，才能保证药材的质量和疗效。丹参中丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量随着生长时间的推移，波动性较大，但两种成分变化趋势十分相似，这可能与植物的生长周期和这两种物质的合成途径有关，有待进一步研究。近几年来学者对丹参中丹酚酸类成分所具有的药理作用正在进一步研究中[6-7]其可能对肝肾具有保护作用等。所以，丹参中酚酸类成分的药理活性研究对于增进人体健康、防治疾病等方面至关重要。本实验后续还应进一步充分研究丹参中酚酸类化学物质的变化规律，以期对丹参药材不同产地加工方法与炮制一体化工艺研究[8-10]提供相关实验数据。