细胞凋亡和程序性坏死在心肌缺血再灌注损伤中的作用研究

2022-02-12郭双吕勃

心血管病学进展 2022年12期

郭双吕勃

(1.西安市第一医院心血管内科，陕西西安 710002；2.哈尔滨医科大学附属第二医院心内科，黑龙江哈尔滨 150081)

心血管疾病一直是威胁人类健康的疾病之首，冠状动脉的急性闭塞，会进展为心肌梗死(myocardial infarction，MI)，是导致患者死亡的急症之一。尽管可以通过抗凝、抗血小板药治疗、冠状动脉介入等手段来实现冠状动脉血运复流，但同时也伴随心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)。针对此问题，关于心肌细胞死亡的研究愈发增加，其中细胞凋亡和程序性坏死两种研究较多。两种方式的发生各有异同，但二者中何者在MIRI中作用更大，迄今未见相关报道，此研究是进一步证实在心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)中主要存在的细胞死亡方式，更好地理解两种细胞死亡方式的具体作用，为指导临床通过抑制或者干预其发生，对心肌保护提供治疗新方向。

心肌发生缺血梗死后进行冠状动脉再通从而实现血流再灌注的过程中，血运重建所带来的损伤以及缺血本身的双重损伤，称为MIRI[1]。MIRI是多种因素作用的结果，其中包括氧自由基增加，胞内Ca2+超载，pH迅速恢复，线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)开放，炎症反应[2]以及细胞凋亡和细胞坏死。目前MIRI的四种表现形式中，心肌顿挫和再灌注心律失常是可逆的，而微血管阻塞和致死性心肌再灌注损伤则是不可逆的[2]。MIRI是发生MI后的重要病理反应之一。MI早期，冠状动脉闭塞导致血供不足，发生缺血缺氧改变。MI晚期，再灌注使血管再通及代偿性血供复流，MIRI作为一个结果发生。可见MIRI是MI过程中引起缺血缺氧的关键病理过程之一，而在MIRI中贯穿多种细胞死亡方式，进一步明确各种死亡方式在MIRI中的具体作用有助于进一步指导MIRI的靶向治疗。MIRI的出现使得如何减少再灌注损伤成为研究学者关注的热点，从而进一步指导临床将心肌保护作用发挥到最大。

MIRI中，细胞凋亡和程序性坏死均有参与。细胞凋亡的发生在MIRI中，内外途径最终会通过胱天蛋白酶-3(caspase-3)共同通路来介导。而研究[3]表明程序性坏死在I/R损伤中，是通过特异蛋白受体相互作用蛋白激酶-3(receptor-interacting protein kinase-3，RIP3)-Ca2+-钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase，CaMKⅡ)-MPTP途径来介导的。两种死亡方式贯穿于I/R损伤，但具体哪一种死亡方式作用更大，通过干预或者阻断哪一种细胞死亡方式能够获益最大，暂未明确，故引出本研究课题的目的。

1 材料及方法

1.1 动物

选择6～8周龄雄性C57/BL6小鼠，体重约25 g，于哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心购买，由实验室专业人员饲养。在12/12 h的明暗循环下，室温(22～24 ℃)正常湿度下喂食食物和无菌过滤水。实验经过哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验伦理委员会通过(伦理号:2014-研-068)。

1.2 主要仪器

电子天平(上海恒平)，低温高速离心机(美国Thermo)、HX-100小动物呼吸机(成都泰盟科技)、卤素冷光源(上海明日光学仪器)、多功能酶标仪(瑞士Tecan)、恒温摇床和恒温箱(美国Thermo)。

1.3 主要试剂

10%水合氯醛、多聚甲醛(中国biosharp)、KN93和ZVAD(美国MedChemExpress)、氯化三苯基四氮唑(Triphenyl tetrazolium chloride，TTC)(赛国生物科技)，心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)ELISA试剂盒(武汉Elabscience)。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒和白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA试剂盒(中国联科生物)。抗RIP3和抗caspase-3(美国Sigm-Aldrich)。β-action和抗IgG(中国中杉金桥)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组

将小鼠随机分为四组：假手术(sham)组、I/R组、ZVAD组和KN93组；每组各10只。

1.4.2 建立MIRI模型

用10%水合氯醛(0.01 mL/10 g)麻醉小鼠，固定后行气管插管并连接小鼠呼吸机(参数：潮气量为2.2 L/min，呼吸比为5:4，呼吸频率为110 次/min)。在小鼠左侧第四肋间与肋骨平行做一长2～3 cm的切口暴露心脏，在左心耳下缘与肺动脉圆椎交界处左心耳下缘的垂直线上，距离左心耳下缘1～2 mm处6-0丝线进针结扎冠状动脉前降支，缺血30 min后解除结扎，再灌注1 h(结扎远端心肌变白则缺血成功，解除结扎后远端心肌恢复颜色即造模成功)。

1.4.3 抑制剂干预处理

抑制剂注射时间为缺血前15 min，行腹腔注射，见图1。

注：DMSO，二甲基亚砜。图1 实验分组示意简图

1.4.4 MI面积的测定

建模后取材，置于-20 ℃冰箱20 min沿垂直于左心室(left ventricle，LV)长轴切片，每片心肌厚度2 mm，置于2%TTC溶液中，37 ℃孵育15 min，多聚甲醛溶液固定过夜。拍照后用Image-J软件处理。测量梗死面积(infarct size，IS)和LV面积。各组之间IS大小应用IS/LV%进行比较。

1.4.5 心肌损伤标志物的测定

建模后收集血液，离心取血清。取cTnI试剂盒，用酶标仪来检测其在450 nm处的吸光度，绘制标准曲线图，计算cTnI表达水平。

1.4.6 炎性反应因子的测定

建模后收集血液，离心取血清，分装后-20 ℃保存。取TNF-α、IL-1β试剂盒，用酶标仪来分别检测血清中炎性因子指标TNF-α和IL-1β在450 nm和570 nm处的吸光度，绘制标准曲线图，计算 TNF-α和IL-1β表达水平。

1.4.7 特异蛋白的表达

取LV，剪碎后裂解匀浆，离心提取上清液BCA法测蛋白浓度，取等量的总蛋白50 μg上清液，10%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离蛋白，然后将蛋白转至0.2 μm的聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂牛奶的TBS液封闭，一抗稀释后37 ℃孵育30 min，60 r/min摇床30 min，4 ℃过夜。第二天取膜后TBST洗膜5次、6 min/次，加入二抗[抗RIP3(1：1 000)、抗caspase-3(1：1 000)和β-action]常温孵育2 h，100 r/min摇床30 min，洗膜5次、6 min/次，加入增强化学发光液进行曝光，测定蛋白条带相对光密度值进行比较。

1.4.8 统计学处理

2 结果

2.1 MI面积的结果分析

如图2A示，MI部分显示为白色，心肌存活部分显示为红色，ZVAD和KN93组相比I/R组，MI面积有所缩小。图2B示，ZVAD和KN93组相比I/R组减少(P<0.05)，而KN93组减少更为显著。说明ZVAD和KN93可以减轻I/R损伤，而KN93抑制作用更大。

注：*表示与I/R组比较，P<0.05；#表示与ZVAD组比较，P<0.05。图2 MI面积与MI面积分析

2.2 心肌标志物肌钙蛋白的结果分析

cTnI是心肌损伤标志物中特异性和敏感性较高的一个指标，用以衡量心肌损伤的程度。如图3所示，在I/R组，cTnI水平明显升高(P<0.01)，而ZVAD和KN93处理后，cTnI明显下降(P<0.05)，KN93组cTnI水平明显低于ZVAD组(P<0.05)，表明ZVAD和KN93可以一定程度上减轻心肌损伤，KN93干预即抑制程序性坏死的发生，其心肌保护作用更大。

注:*表示与sham组比较,P<0.01;**表示与I/R组比较,P<0.05;#表示与ZVAD组比较,P<0.05。图3 心肌肌钙蛋白分析

2.3 炎性指标的结果分析

本研究选择TNF-α和IL-1β两种炎症因子来衡量炎症反应的程度。如图4所示，I/R损伤会加重炎性因子的表达，而在使用两种抑制剂后炎症反应有所减轻。图4A中IL-1β在I/R中明显升高(P<0.01)，而在ZVAD和KN93中明显降低(P<0.05)，KN93组降低更为显著。图4B中TNF-α也是在ZVAD和KN93处理后明显下降(P<0.05)，表明ZVAD和KN93可以通过抑制细胞死亡来减轻炎性因子的表达，且KN93抑制作用更为明显，提示程序性坏死可能在I/R中占比更大。

注：*表示与sham组比较，P<0.01；**表示与I/R组比较，P<0.05；#表示与ZVAD组比较，P<0.05。图4 IL-1β与TNF-α的结果分析

2.4 特异蛋白的表达结果分析

选择caspase-3和RIP3分别作为细胞凋亡和程序性坏死通路中的特异蛋白，结果如图5所示。I/R组与sham组相比，caspase-3和RIP3的表达均显著升高(P<0.05)，而ZVAD和KN93组相对于I/R组二者的表达有所减少。其中RIP3的表达，KN93组相比I/R组显著下降(P<0.05)，而ZVAD组相比I/R组有所下降，但无统计学意义；caspase-3的表达，KN93组相比I/R组无统计学意义，而ZVAD组相比I/R组显著下降(P<0.05)。表明在ZVAD处理抑制I/R损伤的过程中，细胞凋亡蛋白caspase-3下降，KN93抑制I/R损伤的过程中，程序性坏死特异蛋白RIP3下降。

注：*表示与sham组比较，P<0.05；ns表示与I/R组比较，P>0.05；**表示与I/R组比较，P<0.05。图5 蛋白印迹检测特异蛋白的表达水平及RIP3和caspase-3蛋白的定量分析

3 讨论

MIRI是发生MI后的重要病理反应之一，其发生是多种因素共同参与的结果。MIRI的出现使得如何减少I/R损伤成为学者关注的热点。而针对MIRI中多种细胞死亡方式的研究中，细胞凋亡和程序性坏死较多。既往的研究只关注于其中一种死亡方式，鲜有将二者进行直接比较的研究，故本研究主要目的是进一步明确这两种死亡方式何者占比更大。抑制心肌细胞死亡，来减轻心肌损伤，将有利于研究I/R损伤的心肌保护。

该实验构建I/R模型，分别使用ZVAD和KN93两种特异抑制剂来阻断通路的发生，来评价细胞凋亡和程序性坏死两种死亡方式在MIRI中作用的差异。从形态学、病理学、炎症反应和特异蛋白等方面来进行直接比较，明确二者作用大小，指标选择IS、cTnI、炎性因子TNF-α和IL-1β，以及特异蛋白caspase-3和RIP3。IS和心功能是评价心肌I/R损伤程度的主要指标[4]，而心肌收缩的调节蛋白中cTnI相比肌酸激酶同工酶、肌红蛋白敏感度和特异度相对较高[5]。炎症反应贯穿MIRI的病理反应[6]，其中TNF-α在I/R诱导的炎症反应中发挥始动功能且可以诱导IL-1β的释放[7]。caspase-3是细胞凋亡发生通路中的共同节点，因此选择caspase-3作为细胞凋亡发生过程中的特异蛋白。经典坏死的发生在I/R损伤中是通过RIP3-CaMKⅡ-MPTP途径介导[3]，不需要RIP1的参与，故选择RIP3作为细胞程序性坏死发生过程中的特异蛋白。

ZVAD作为泛caspase的抑制剂，通过抑制caspase的活性可以减轻I/R损伤[8]。既往研究[9]表明，在I/R的动物模型中发现在缺血前给予ZVAD抑制剂注射后，MI面积缩小。本研究结果显示：ZVAD处理后，相比I/R组，MI面积减少(P<0.05)，cTnI表达明显下降(P<0.05)，炎性指标TNF-α和IL-1β表达有所降低(P<0.05)。caspase-3的表达，I/R组相比sham组显著升高(P<0.05)，ZVAD组相比于I/R组表达有所减少。表明ZVAD可以通过抑制caspase-3激酶活性的表达来减少心肌死亡。既往研究选择程序性坏死的抑制剂是RIP1特异性抑制剂(Necrostatin-1，Nec-1)，作为RIP1的特异性抑制剂。Dmitriev等[10]发现在心脏I/R损伤中，Nec-1处理可以减少心肌损伤，但RIP1亦会通过复合体Ⅱb来介导细胞凋亡的发生。Nec-1减轻心肌细胞死亡，具体是抑制细胞凋亡还是抑制程序性坏死，此问题并不明确，选择Nec-1作为I/R损伤中程序性坏死的抑制剂，特异性并不是很高。近期研究[3]表明程序性坏死在心肌I/R中由RIP3-CaMKⅡ-MPTP通路介导，不同于既往研究，本实验选择KN93作为程序性坏死抑制剂。KN93是CaMKⅡ的抑制剂，靶向作用CaMKⅡ可以调节I/R中细胞死亡[11-12]。本研究结果显示：KN93处理后，与I/R组相比，MI面积有所缩小，心肌损伤明显减少，炎性反应有所减轻(P<0.05)。I/R组RIP3表达显著升高(P<0.05)，KN93组相对于I/R组RIP3表达有所减少，且KN93组MI面积、心肌损伤和炎性反应均低于ZVAD组。表明KN93可以减轻心肌损伤，相比较ZVAD处理抑制心肌细胞发生死亡更明显，心肌保护作用更大。KN93干预后，RIP3活性表达有所下降，但KN93如何干预上游因子RIP3减轻程序性坏死的发生，从而减轻心肌损伤，具体分子机制有待进一步研究。

尽管使用小鼠MI模型研究MIRI具有很大优势，但仍有局限性：(1)本实验给药时间在缺血之前，在临床实践中很难做到缺血之前预处理，可能会限制ZVAD和KN93的临床应用，此部分可以增加不同给药时间来进一步完善；(2)单一再灌注时间不利于更加整体地观察细胞凋亡和程序性坏死的发生发展过程，后期可增加多个观察时间来全面评价二者作用大小；(3)实验小鼠是基于健康动物，无糖尿病、高血压等，不能提供与人类MI相关的完美的病理模拟。未来需要进一步在具有基础疾病或者某些药物处理的小鼠中进行研究，为未来临床治疗提供参考。