中华疣海星中化学成分的分离和鉴定

陆云阳 李虎 刘杨 田韵远 胡晋铭 邱鹏程 汤海峰

海星(starfish)是一类无脊椎底栖海洋动物，以鱼虾贝类为食，属于棘皮动物门(Echinodermat)海星纲(Asteroidea)。据统计全球现存海星1900余种，分属于项链海星目(Brisingida)、钳棘目(Forcipulatida)、桩海星目(Paxillosida)、有棘目(Spinulosida)、瓣海星目(Valvatida)、帆海星目(Velatida)和Notomyotida等7目，共36科约370属，其中生活在中国周边海域的约120余种[1]。海星入药最早见于《本草纲目》，主要作为中国沿海地区的民间用药[2]。《中华海洋本草》记载其具有软坚散结、和胃止痛之功效，主要用于治疗甲状腺肿大、淋巴结核、瘿瘤、瘰疬、胃痛泛酸等症[3]。化学研究表明海星含有甾体、甾体皂苷、蒽醌、生物碱、多肽、磷脂和脂肪酸等多类成分，这些化合物具有肿瘤细胞毒性、溶血、抗病毒、抗真菌和抗其他微生物等多种生物活性[4-6]。中华疣海星(Pentacerasterchinensis)属于瓣海星目瘤海星科(Oreasteridae)疣海星属，是在中国南海海域发现的特有种，而且分布广泛[7]。目前，针对中华疣海星的化学成分研究报道较少[8-9]。为了阐明其化学成分，为其科学的开发利用提供依据，在前期课题组对中华疣海星中的甾体皂苷类成分研究的基础上[10-11]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Bruker AVANCE III 500 MHz核磁共振波谱仪(Bruker，德国)；Micromass Quattro质谱仪(Waters，美国)；Dionex P680高效液相色谱仪(Dionex，德国)[配YMC Pack ODS-A色谱柱(250 mm × 20 mm，5 μm；250 mm × 4.6 mm，5 μm)]；Sartorius电子天平(赛多利斯，德国)；柱色谱硅胶100～200目、300～400目(青岛海洋化工有限公司，中国)；Sephadex LH-20凝胶(GE Health Care，美国)；C18反相硅胶(Merck，德国)；色谱纯乙腈(天津科密欧公司)；其他试剂均为分析纯。

1.2 动物样本

中华疣海星于2015年3月采集于海南省琼州市以东海域，经中国科学院海洋研究所肖宁博士鉴定为中华疣海星Pentacerasterchinensis，标本保存于中国科学院海洋生物标本馆。

1.3 提取分离

1.3.1 中华疣海星的提取 中华疣海星总重12 kg(湿重)，铡刀切碎后用75%乙醇回流提取3次，每次2小时。然后合并3次提取液，用旋转蒸发仪减压蒸馏，回收乙醇得浸膏。将乙醇浸膏均匀分散于纯水中，用等体积的石油醚萃取5次，以除去脂溶性成分。然后，用水饱和正丁醇萃取5次，回收水饱和正丁醇层，即得正丁醇萃取物88 g。

1.3.2 单体化合物的分离 正丁醇萃取物溶解后用硅胶拌样，然后上硅胶柱色谱进行分离纯化，用氯仿—甲醇—水(40∶1∶0 ～ 6.5∶3.5∶1)梯度洗脱，每500 mL收集一次洗脱液，旋蒸后用薄层色谱展开，显色剂检测后合并，总共得19个部分Fr.A-Fr.S。Fr.G(4.47 g)部分，先用Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化，氯仿—甲醇(1∶1)等度洗脱以除去杂质。然后用C18反相硅胶柱色谱进行分离，洗脱液为甲醇—水(1∶3 ～ 1∶0)梯度洗脱，收集洗脱液，每100 mL为一个组分，旋蒸后用薄层色谱展开，显色剂检测后进行合并，最终一共合并得到3个部分(Fr.G1 ～ Fr.G3)。其中Fr.G2(60.5 mg)通过半制备高效液相色谱进行分离纯化，流动相为68%乙腈水溶液(加0.05%三氟乙酸)，流速6 mL/min，分离得到化合物1(4.0 mg)和2(9.6 mg)。

Fr.H(2.94 g)部分用Sephadex LH-20凝胶柱进行纯化，氯仿—甲醇(1∶1)等度洗脱以除去杂质。经过凝胶柱纯化后的Fr.H部分继续上C18反相硅胶柱色谱进行分离，洗脱液为甲醇—水(1∶3 ～1∶0)，收集洗脱液，旋蒸后用薄层色谱展开，显色剂检测后进行合并，最终从Fr.H部分共得到3个部分(Fr.H1 ～ Fr.H3)。其中Fr.H2(85 mg)通过半制备高效液相色谱进行分离纯化，流动相为70%乙腈水溶液(加0.05%三氟乙酸)，流速6 mL/min，分离得到化合物3(15.0 mg)和4(12.2 mg)。

2 结果

2.1 结构鉴定

通过综合分析分离所得化合物1～4的核磁和质谱数据，解析出其化学结构(图1)。详细解析过程如下。

2.2 化合物1

化合物1，白色粉末，Liebermann-Burchard反应呈阳性，表明其可能是甾体类化合物。电喷雾质谱(Electron Spray Ionization-Mass Spectrum, ESI-MS)给出其准分子离子峰为m/z457 [M + Na]+和m/z433 [M - H]-，结合化合物的核磁共振碳谱(13C Nuclear Magnetic Resonance,13C NMR)数据，推测其分子式为C27H46O4。

综合分析其1H NMR和13C NMR信号，发现化合物分子中存在5个甲基，其碳氢化学位移分别为δH0.98 (s)与δC15.2 (C-18)、δH0.89 (s)与δC14.0 (C-19)、δH1.01 (d,J= 6.3 Hz)与δC20.4

图1 从中华疣海星中分离鉴定到的

(C-21)、δH0.91 (d,J= 6.5 Hz)与δC18.6、δH0.86(d,J= 6.5 Hz)与δC18.5；一个双键δH5.52与δC138.5和δH5.42 (dd,J= 14.8, 6.8 Hz)与δC130.2；以及4个连氧次甲基δH3.48与δC72.3、δH3.39与δC69.8、δH4.12与δC70.5、δH3.65与δC78.7。以上特征NMR信号表明化合物1可能是一个多羟基甾醇类化合物。根据1H NMR、13C NMR、DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer)和HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence)谱数据，对化合物的所有碳氢信号进行了归属(表1)。根据化合物1H-1H COSY(1H-1H correlation spectroscopy)谱的相关信号，可以得到连续的结构片段：H-1/H-2/H-3/H-4/H-5/H-6/H-7/H-8/H-9、H-9/H-11/H-12、H-8/H-14/H-15/H-16/H-17、H-17/H-20/H-21、H-20/H-22/H-23/H-24/H-25/H-26/H-27。在HMBC谱中H3-19与C-1、C-5、C-9和C-10相关，H3-18与C-12、C-13、C-14和C-17相关，H3-21与C-17、C-20和C-22相关，H3-26与C-24、C-25和C-27相关；H-22与C-17和C-20相关，H-23与C-20、C-24和C-25相关，从而可构建化合物1的平面结构，并表明双键位于C-22(C-23)位。根据H-23的偶合常数J= 14.8推测双键为反式构型。在NOESY(Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy)谱中，H-3与H-5相关，表明H-3为α构型；H-6与H-8和H3-19相关，表明H-6是β构型；H-14与H-15和H-17相关，表明H-15是α构型。通过与文献中具有22E-双键-24-羟基的化合物中C-24位碳氢核磁数据的对比，表明化合物1的C-24为R构型。综上所述，鉴定化合物1的结构为(24R, 22E)-胆甾-22-烯-3β,6α,15β,24-四醇，即已知化合物certonardosterol G，其波谱数据与文献一致[12]。

2.3 化合物2

化合物2，白色无定形粉末，Liebermann-Burchard反应呈阳性，表明其可能是甾体类化合物。ESI-MS给出其准分子离子峰为m/z473 [M+Na]+和m/z449 [M-H]-，结合化合物的13C NMR谱数据，推测其分子式为C27H46O5。

化合物的1H NMR谱中存在5个甲基氢信号，包括2个单峰甲基氢δH0.96和1.28、3个双峰甲基氢δH0.88 (J=6.7 Hz)、0.90 (J=6.7 Hz)和0.99 (J=6.5 Hz)。还存在2个烯氢信号δH5.53、δH5.45 (dd,J=15.0, 6.5 Hz)；4个连氧次甲基氢信号δH3.48、3.65、3.86和4.40。通过HSQC谱找到与以上氢信号对应的甲基碳信号分别为δC14.2、16.5、18.6、18.5和20.4，双键碳信号为δC138.6和132.5，连氧次甲基碳信号为δC72.0、78.9、68.2和70.5。根据1H NMR、13C NMR、DEPT和HSQC谱数据，对化合物2的所有碳氢信号进行了归属(表1)。对比化合物2与化合物1的核磁数据，发现这两个化合物具有相似的化学结构。不同点在于与化合物1相比，化合物2的碳信号中少了一个δC32.2次甲基碳信号，多了一个δC77.7连氧季碳信号。2D NMR分析表明，化合物2为化合物1的C-8位羟基取代产物，由生源途径分析推测8-OH为β构型。因此，确定化合物2的结构为(24R, 22E)-胆甾-22-烯-3β,6α,8β,15β,24-五醇，其波谱数据与文献中报道的已知化合物一致[13]。

2.4 化合物3

化合物3，白色无定形粉末，Liebermann-Burchard反应呈阳性，表明其可能是甾体类化合物。ESI-MS给出其准分子离子峰为m/z475 [M + Na]+和m/z451 [M-H]-，结合化合物的13C NMR谱数据，推测其分子式为C27H48O5。

分析化合物的1H NMR和13C NMR谱数据，发现化合物分子中存在4个甲基信号，碳氢化学位移分别为δH0.93 (s)与δC16.4 (C-18)、δH0.85 (s)与δC13.6 (C-19)、δH0.96 (d,J= 6.5 Hz)与δC18.3 (C-21)、δH0.95 (d,J= 6.8 Hz)与δC17.6 (C-27)；另有4个连氧次甲基信号，碳氢化学位移分别为δH3.49与δC71.9、δH3.35与δC69.8、δH4.12与δC70.3、δH4.29与δC72.8；1个连氧亚甲基δH3.55 (dd,J= 10.3, 5.7 Hz)/3.68 (dd,J= 10.1, 6.8 Hz)与δC67.9。以上特征信号表明化合物3是一个多羟基甾醇类化合物。根据1H NMR、13C NMR、DEPT和HSQC谱数据，对化合物3的所有碳氢信号进行了归属(表1)。结合2D NMR分析，通过检索发现化合物3与文献报道的化合物(25S)-胆甾-3β,6α,15β,16β,26五醇波谱数据一致，从而确定了其结构[14]。

表1 化合物1～4的13C NMR (CD3OD, 125 MHz)和1H NMR (CD3OD, 500 MHz)数据

2.5 化合物4

化合物4，白色粉末，Liebermann-Burchard反应呈阳性，表明其可能是甾体类化合物。ESI-MS给出其准分子离子峰为m/z491 [M + Na]+和m/z467 [M-H]-，结合化合物的13C NMR谱数据，推测其分子式为C27H48O6。

根据化合物4的1H NMR、13C NMR、DEPT和HSQC谱数据，对其所有的碳氢信号进行了归属(表1)。分析上述数据发现，化合物分子结构中有4个甲基信号，其碳氢化学位移分别为δH1.19 (s)与δC17.6 (C-18)、δH0.98 (s)与δC13.7 (C-19)、δH0.95 (d,J= 6.0 Hz)与δC18.2 (C-21)、δH0.94 (d,J= 6.7 Hz)与δC17.5 (C-27)；4个连氧次甲基信号，其碳氢化学位移分别为δH3.55与δC71.7、δH3.86与δC67.1、δH4.43与δC70.7、δH4.25与δC73.1；1个连氧亚甲基δH3.55 (dd,J= 10.3, 5.8 Hz)/3.66 (dd,J= 10.2, 6.9 Hz)与δC67.8；1个连氧季碳δC76.7。以上特征数据表明，化合物4是一个多羟基甾醇类化合物。通过比对化合物4和化合物3的碳氢数据，发现这两个化合物具有相似的化学机构，不同点在于化合物4的结构中少了一个次甲基(δH1.92与δC31.3)，而多了一个连氧季碳(δC76.7)。以上信息表明化合物4是化合物3的羟基取代产物，2D NMR分析表明羟基取代于C-8位，由生源途径分析推测8-OH为β构型。综上所述，确定化合物4的结构为(25S)-胆甾-3β,6α,8β,15β,16β,26-六醇，其波谱数据与文献中报道的已知化合物一致[15]。

3 讨论

海洋是地球上最大的生态系统，其中的海洋生物孕育了大量具有特殊化学结构和多样生物活性的物质。然而，目前对海洋生物资源的开发利用仍十分有限。中华疣海星是中国的特有海洋生物品种，在中国南海分布广泛，种群数量巨大，亟待开发。本文运用色谱分离技术和波谱解析技术从中华疣海星中分离鉴定了4个多羟基甾醇类化合物，均为首次从该属海星中分离得到，从而为中华疣海星成分多样性提供了实验数据支持。后续将开展该动物化学成分药理活性方面的研究，为其资源的进一步开发提供充足的科学依据。