巴山重楼的甾体皂苷类化学成分的分离和鉴定

田韵远 樊培 陆云阳 刘杨 陈文文 胡晋铭 曹宇 袁晓峰 李天怡 汤海峰

中药重楼为百合科(Liliaceae)重楼属植物云南重楼[ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.]和七叶一枝花[P.polyphyllaSmithvar.chenensis(Franch.) Hara]的干燥根茎，具有清热解毒、消肿止痛和凉肝定惊的功效[1]。云南白药、热毒清片和宫血宁胶囊等多种中成药的主要药材均为重楼。对重楼属植物化学成分的研究始于60年代初，黄伟光等[2]从云南重楼中分离得到薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元。近年来，对中药重楼化学成分和药理作用的研究报道越来越多，研究表明重楼的主要药效成分是甾体皂苷，亦总称为重楼皂苷，具有抗肿瘤、抗菌、抗心肌缺血、抗氧化等多方面的生物活性[3-5]。重楼的药用价值被不断发掘，基源植物被大量采摘，且该植物生长周期长、自然更替缓慢，使得其自然资源严重紧缺，出现了供不应求的现象，价格连年攀升[6-7]。在广泛开展重楼人工培育的同时，从民族民间药特别是重楼属其他植物中寻找新的替代资源是解决其资源匮乏的重要途径。

巴山重楼(Parisbashanensis)主要分布于湖北、重庆和四川等地，经作者考察，在陕南亦有分布。巴山重楼的根茎是土家族的常用药材，被称为“露水珠”，具有散寒祛湿、通络止痛和止血生津的功效，主要用于头痛、痢疾和毒虫咬伤等疾病的治疗[8-9]。目前，包括本课题组的研究工作在内[10]，仅报道从巴山重楼中分离鉴定了19个化合物[11-12]，对其化学成分的研究不够充分，有待进一步阐明其所含化学成分。本研究在前期工作的基础上，继续报道对巴山重楼根茎中甾体皂苷类化学成分的研究工作，进一步开展其皂苷类成分的研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Quatrro Micro质谱仪(Micromass公司)；Bruker AVANCE 800型核磁共振波谱仪(Bruker公司)；戴安P680高效液相色谱仪(P680系列单泵、UV-VS 检测器、CHROMELON工作站)[配YMC-Pack R&D ODS-A半制备色谱柱(20 mm × 250 mm，5 μm)]；Agilent GC-6820气相色谱仪[配HP-5弹性石英毛细管柱(30 m × 0.32 mm，0.25 μm)，氢火焰离子化检测器]；ODS C18柱(Pharmacia公司)；Sephadex LH-20凝胶(GE公司)；柱色谱硅胶(100～200目、200～300目)、薄层色谱用硅胶H、预制硅胶板G(青岛海洋化工厂)；RP-18高效薄层预制板(Merck公司)。色谱纯甲醇(天津科密欧公司)；氘代试剂(Merck公司)；标准品D-葡萄糖(D-glucose, D-Glc)、L-鼠李糖(L-rhamnose, L-Rha)和D-半乳糖(D-galactose, D-Gal)(Sigma公司，纯度≥ 99%)；显色剂(10%硫酸/乙醇溶液)；其他试剂均为分析纯。

药材于2018年9月采自陕西省安康市镇坪县，经空军军医大学药学系中药与天然药物学教研室汤海峰教授鉴定为巴山重楼(ParisbashanensisWang et Tang)的根茎，药材标本(编号：20189013)保存在空军军医大学药学系中药与天然药物学教研室标本室。

1.2 化学成分的提取与分离

干燥的巴山重楼根茎0.8 kg，用70%乙醇浸泡过夜，加热回流提取5次，每次2小时，减压回收溶剂得醇提浸膏210 g。将浸膏加适量水分散，用等体积石油醚萃取5次，再用等体积水饱和正丁醇萃取6次，合并回收正丁醇层得到总皂苷160 g。所得总皂苷经硅胶柱色谱，用V二氯甲烷∶V甲醇∶V水(80∶1∶0 ～ 65∶35∶10)为洗脱剂梯度洗脱，合并得到25个组分(Fr.1 ～ Fr.25)。根据薄层色谱展开情况，选取Fr.6、Fr.8、Fr.11、Fr.12和Fr.13分别经Sephadex LH-20凝胶柱色谱(洗脱剂为甲醇)除去水溶性杂质后，再经反相硅胶柱色谱，以V甲醇∶V水(80∶20 ～ 40∶60, v/v)梯度洗脱，得到Fr.6-2-1、Fr.8-3-2、Fr.11-1-1、Fr.12-1-1和Fr.13-2-1。Fr.6-2-1以60%乙腈为流动相，通过半制备高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)；流速10 mL/min，检测波长206 nm(以下色谱条件均相同)，分离得到化合物3(9.5 mg)、7(7.9 mg)和Fr.6-2-1-2，Fr.6-2-1-2以50%乙腈为流动相，通过半制备HPLC纯化得到化合物1(16.9 mg)。Fr.8-3-2以55%乙腈为流动相，通过半制备HPLC纯化得到化合物6(35 mg)、9(9.7 mg)和5(14.9 mg)。Fr.11-1-1通过半制备HPLC，以70%乙腈为流动相，分离得到化合物10(9.3 mg)。Fr.11-1-1以50%乙腈为流动相，分离得到化合物8(8.5 mg)。Fr.13-2-1以55%乙腈为流动相，分离得到化合物4(34.7 mg)和2(18.9 mg)。

2 结果

2.1 结构鉴定

根据核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance, NMR)和质谱(mass spectrum, MS)数据，对比文献报道中的波谱数据，结合理化性质、酸水解结果，鉴定了10个化合物的化学结构，并对所得化合物进行结构解析。

2.2 化合物1

化合物1为白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)显示其准分子离子峰为m/z760 [M + Na]+和737 [M - H]-，结合化合物的13C NMR谱(200 MHz, C5D5N)数据推断其分子式为C39H62O13。在1H NMR谱(800 MHz, C5D5N)高场区显示4个甲基氢信号：δH0.85 (s), 1.01 (s), 1.17 (d,J= 6.8 Hz), 0.89 (d,J= 6.0 Hz)，一组三取代烯烃氢信号δH5.30 (br s)。结合1H的异核单量子相关谱(1H detected heteronuclear single quantum coherence, HSQC)，在13C NMR谱中显示4个对应甲基碳信号δC17.1、20.0、9.3和17.3，一组对应的三取代烯烃碳信号δC141.3和122.8，以及2个季碳信号δC38.1和44.9、1个含氧季碳信号δC91.8和1个半缩醛季碳信号δC111.9。H2-26化学位移值的差(ΔδH= 3.78-3.43 = 0.35 < 0.48)，可以确定C25为R构型[13]，以上数据表明化合物1是异螺甾烷醇型甾体皂苷[14]。在1H的异核多健相关谱(1H detected heteronuclear multiple bond correlation, HMBC)中，δH2.78 (H-4)、1.90 (H-7)与C-5、C-6分别存在远程相关信号，表明双键位于5(6)位。化合物1的C-16和C-17信号分别为δC91.1和91.8，表明化合物1的C-17位连有羟基，按照生源途径，该羟基应为α构型[15]。在核欧沃豪斯效应谱(nuclear Overhauser effect spectroscopy, NOESY/NOE)中，H3-19β/H-1b (δH4.08)和H-1a (δH0.96)/H-3 (δH3.85)的NOE相关峰表明3-OH是β构型[16]。综上分析，化合物1的苷元为偏诺皂苷元[17]。苷元部分的13C NMR数据见表1。

图1 从巴山重楼中分离的化合物1～10的化学结构

取化合物1 用2 mol/L三氟乙酸水解，按文献方法[10,18]将所得单糖制备三甲基硅醚化L-半胱氨酸衍生物，以标准糖衍生物作对照，进行GC分析，表明化合物1的单糖组成为D-Glc和L-Rha (1∶1)。在1H NMR谱中显示2个糖基的端基氢信号δH4.95 (d,J= 7.6 Hz, Glc Ⅰ)和6.41 (br s, Rha Ⅰ)。在HSQC谱中可找到各端基氢所对应的端基碳信号δC100.6和102.3。由葡萄糖端基氢的偶合常数(J> 7.0 Hz)可知葡萄糖形成的苷键为β构型；由鼠李糖C-3和C-5化学位移分别为δC72.5和69.7可知鼠李糖形成的苷键为α构型[19-20]。在HMBC谱中，Glc Ⅰ C-1与苷元C-3存在远程相关峰，说明Glc Ⅰ连接于苷元C-3位；Rha Ⅰ的H-1与Glc Ⅰ的C-4存在远程相关，表明Rha Ⅰ连接于Glc Ⅰ的4位。糖基部分的13C NMR数据见表2。化合物1的波谱数据与文献报道的重楼皂苷Ⅵ的数据一致[21]，从而确定化合物1为偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，即重楼皂苷Ⅵ。

2.3 化合物2

化合物2为白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰为m/z891 [M + Na]+和867 [M - H]-，结合化合物的13C NMR谱(200 MHz, C5D5N)数据推断其分子式为C45H72O16。化合物2苷元部分的碳谱信号与化合物1的信号基本一致，不同之处在于化合物2苷元部分的C-16和C-17信号分别向高场位移至δC81.9和62.4，结合文献报道的波谱数据[22]，确定化合物2的苷元为薯蓣皂苷元。将化合物2按照与化合物1相同的方法酸水解后制备成单糖衍生物，通过GC分析表明其糖基为D-Glc和L-Rha (1∶1)。通过二维核磁共振波谱(Two Dimension Nuclear Magnetic Resonance, 2D NMR)分析归属了化合物2的所有碳氢信号，化合物2的碳谱数据见表1和表2，重要的1H NMR(800 MHz, C5D5N)信号如下：δH0.93 (s, H3-18), 1.13 (s, H3-19), 1.32 (d,J= 5.4 Hz, H3-21), 0.95 (d,J= 7.3 Hz, H3-27), 5.30 (br s, H-6), δH4.96 (d,J= 8.3 Hz, Glc Ⅰ H-1), 6.42 (br s, Rha Ⅰ H-1)和6.32 (br s, Rha Ⅱ H-1)。化合物2的波谱数据与文献报道的化合物一致[23]，从而确定化合物2为薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.4 化合物3

化合物3为白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰为m/z779 [M + Na]+和755 [M - H]-，结合化合物的13C NMR谱(200 MHz, C5D5N)数据推断其分子式为C39H64O14。化合物3苷元部分的碳谱信号与化合物2的信号基本一致，不同之处在于化合物3苷元部分少了一对烯烃信号(δC142.0和121.8)，而多了一个含氧季碳(δC75.5)和一个含氧叔碳信号(δH4.90, δC75.4)。在氢-氢化学位移相关谱(1H-1H correlation spectroscopy,1H-1H COSY)中，可以观察到H-6 (δH4.92, m)/H2-7 (δH2.16, 1.92)/H-8 (δH2.33)/H-9 (δH1.90)的相关信号，以及HMBC谱中H3-19 (δH1.66, s)、H-4β (δH2.95, t,J= 12.1 Hz)和H-6 (δH4.92, m)与C-5 (δC75.5)的相关峰，可以推测羟基位于C-5和C-6位。在NOESY谱中，H3-19 (δH1.66, s)与H-2β (δH2.14)/H-4β (δH2.95, t,J= 12.5 Hz)之间的相关信号表明A/B环是反式连接，5-OH是α构型；H-6 (δH4.92, m) 和H-4α (δH2.44, dd,J= 13.2, 5.2 Hz)的NOE相关表明6-OH是β构型[22]。化合物3通过酸水解及衍生，经GC分析表明其糖基为D-Glc和L-Rha，组成比为1∶1。在1HNMR谱中显示2个糖基的端基氢信号δH4.95 (d,J= 7.3 Hz, Glc Ⅰ)和6.30 (br s, Rha Ⅰ)，HSQC谱中显示对应的端基碳信号δC100.5和102.9。通过一维核磁共振谱(One Dimension Nuclear Magnetic Resonance, 1D NMR)和2D NMR谱将该化合物碳氢信号进行归属，碳谱数据见表1和表2，波谱数据与文献报道的化合物一致[22]，从而确定化合物3为3β,5α,6β-三羟基-(25R)-螺甾-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.5 化合物4

化合物4为白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰为m/z923 [M + Na]+和899 [M-H]-，结合化合物的13C NMR谱(200 MHz, C5D5N)数据推断其分子式为C45H72O18。化合物4苷元部分的碳谱信号与化合物2的信号基本一致，不同之处在于化合物4苷元部分少了两个亚甲基信号(δC35.9, 41.5)，多了两个次甲基信号(δH4.02, 3.51; δC72.3, 55.8)，C-7和C-12分别向低场位移了ΔδC+36.4和 +14.3，表明C-7和C-12位连有羟基。在NOESY谱中，H-1α (δH0.98)与H-6 (δH5.65)、H-6 (δH5.65)与H-9 (δH1.24)/H-7 ( 4.05)以及H-7 (δH4.05)与H-9 (δH1.24)的NOE相关表明7-OH为β构型；H-12 (δH3.58)与H-14 (δH1.45), H-14 (δH1.45)与H-17 (δH2.20), H-16 (δH4.68)与H-17 (δH2.20)以及H3-18 (δH1.15)与H-8 (δH1.85)/H-20 (δH2.17)的NOE相关，表明12-OH为β构型[24]。化合物4通过酸水解及衍生，经GC分析表明其糖基为D-Glc和L-Rha，组成比为1∶2。通过2D NMR分析归属了化合物4的所有碳氢信号，碳谱数据见表1和表2，重要的1H NMR (800 MHz，C5D5N)信号如下：δH1.15 (s, H3-18), 1.24 (s, H3-19), 1.42 (d,J= 6.3 Hz, H3-21), 0.71 (d,J= 5.7 Hz, H3-27), 5.68 (br s, H-6), δH4.95 (d,J= 7.5 Hz, Glc Ⅰ H-1), 5.72 (br s, Rha Ⅰ H-1)和6.27 (br s,J= 1.7 Hz, Rha Ⅱ H-1)。其波谱数据与文献报道的化合物基本一致[24]，从而确定化合物4为3β,7β,12β-三羟基-(25R)-螺甾-5-烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.6 化合物5

化合物5为白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰为m/z939 [M + Na]+和915 [M - H]-，结合化合物的13C NMR谱(200 MHz, C5D5N)数据推断其分子式为C46H76O18。在1H NMR中可看到4个甲基氢信号0.82 (s), 1.05 (s), 1.14 (d,J= 5.8 Hz)和0.68 (s)，一个烯烃质子信号δH5.33 (br s)，在HSQC谱中可以观察到对应的4个甲基碳信号δC17.6, 19.5, 16.2和18.5，一对烯烃碳信号δC142.0和121.8，以及13C NMR中一个含氧季碳信号δC79.6和一个半缩醛季碳信号δC110.5，以上数据与Zhao等[17]从云南重楼中得到的parisyunnanoside A的苷元数据基本一致，据此推测化合物5的苷元具有呋甾烷醇的骨架。在HMBC谱中，1H NMR中的1个甲氧基信号δH5.35 (br s)与C-22有远程相关，且C-21的化学位移值是δC110.5(而不是δC115.5)，表示β-OCH3位于C-22位[25]。将化合物5按照化合物1相同的方法酸水解后制备成单糖衍生物，通过GC分析确定其单糖组成为D-Glc和L-Rha (2∶1)。NMR谱中显示3个糖的端基氢信号和碳信号δH4.92 (d,J= 7.7 Hz, Glc Ⅰ), 6.27 (br s, Rha Ⅰ)和5.07 (d,J= 7.0 Hz, Glc Ⅱ)以及δC101.2 (Glc Ⅰ), 103.3 (Rha Ⅰ)和105.7 (Glc Ⅱ)。由HMBC谱中的远程相关峰可以确定化合物5结构中糖的连接顺序。化合物5苷元和糖基的碳谱数据见表1和表2。通过与文献报道的化合物的波谱数据比较[26]，基本一致，从而确定化合物5的结构为22-甲氧基-3β,26-二羟基-(25R)-呋甾-5-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-α-L-吡喃葡萄糖苷，即icogenin 1。

2.7 化合物6

化合物6为白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰为m/z 1231 [M + Na]+和1207 [M- H]-，结合化合物的13C NMR谱(200 MHz, C5D5N)数据推断其分子式为C58H96O26。化合物6苷元的波谱数据与化合物5的基本一致，区别在于C-26向低场位移了ΔδC+8.1，表明C-26位可能连有糖基。化合物6的三甲基硅醚化L-半胱氨酸衍生物经GC分析表明其糖基为D-Glc和L-Rha，组成比为2∶3。通过2D NMR分析归属了化合物6的所有碳氢信号，苷元和糖基的碳谱数据见表1和表2，重要的1H NMR (800 MHz，C5D5N)信号如下：δH0.86 (s, H3-18), 1.07 (s, H3-19), 1.02 (d,J= 6.5 Hz, H3-21), 0.98 (d,J= 6.0 Hz, H3-27), 5.40 (br s, H-6), 4.55 (d,J= 7.6 Hz, Glc Ⅰ H-1), 4.20 (d,J= 7.8 Hz, Glc Ⅱ H-1), 5.20 (br s, Rha Ⅰ H-1), 4.86 (br s, Rha Ⅱ H-1)和5.27 (br s, Rha Ⅲ H-1)。化合物6的波谱数据与文献中化合物对比基本一致[27]，从而确定化合物6为26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-甲氧基-3β,26-二羟基-(25R)-呋甾-5-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)]-α-L-吡喃鼠李糖苷。

2.8 化合物7

化合物7为白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰为m/z987 [M+Na]+和963 [M-H]-，结合化合物的13C NMR谱(200 MHz, C5D5N)数据推断其分子式为C47H80O20。化合物7与化合物6苷元部分的波谱数据基本一致，区别在于化合物7的C-2向低场位移至δC69.8，表明C-2位连有羟基。化合物7的酸水解单糖衍生物经GC分析表明其糖基为D-Glc和D-Gal (2∶1)。通过2D NMR分析归属了化合物7的所有碳氢信号，苷元和糖基的碳谱数据见表1和表2，重要的1H NMR (800 MHz, C5D5N)信号如下：δH0.89 (s, H3-18), 0.95 (s, H3-19), 1.35(d,J=7.4 Hz, H3-21), 0.90 (d,J=6.2 Hz, H3-27), 5.37 (br s, H-6), 4.84 (d,J=7.3 Hz, Glc Ⅰ H-1), 4.78 (d,J=7.8 Hz, Glc Ⅱ H-1)和4.85 (d,J=8.0 Hz, Gal Ⅰ H-1)。由Gal的端基氢的偶合常数(J> 7.0 Hz)确定其形成的苷键为β构型[28]。与文献报道的化合物cesdiurin Ⅱ的波谱数据进行对照[29]，基本一致，从而确定化合物7的结构为26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-22-甲氧基-3β,2,26-三羟基-(25R)-呋甾-5-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷，即cesdiurin Ⅱ。

2.9 化合物8

化合物8为白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰为m/z1231 [M + Na]+和1207 [M - H]-，结合化合物的13C NMR谱(200 MHz, C5D5N)数据推断其分子式为C57H92O27。在1H NMR谱中可看到4个甲基氢信号δH0.73 (s, H3-18), 1.05 (s, H3-19), 1.62(s, H3-21), 1.02 (d,J= 6.2 Hz, H3-27)和1个烯烃质子信号δH5.46 (s, H-6)。13C NMR谱中的两对烯烃碳信号δC141.3和122.1；δC104.1和153.3。通过与huangjiangsu A[30]和ceparoside C[31]的波谱数据比较，表明两个双键分别位于Δ5(6)和Δ20(21)。化合物8酸水解的单糖衍生物经GC分析表明其糖基为D-Glc和L-Rha (4∶1)。1H NMR谱中显示5个糖的端基氢信号δH4.96 (d,J= 7.3 Hz, Glc Ⅰ H-1), 5.14 (d,J= 7.5 Hz, Glc Ⅱ H-1), 5.25 (d,J= 7.8 Hz, Glc Ⅲ H-1), 4.85 (d,J= 7.0 Hz, Glc Ⅳ H-1), 6.27 (br s, Rha Ⅰ H-1)。通过2D NMR分析归属了化合物8的所有碳氢信号，苷元和糖基的碳谱数据见表1和表2。对照发现化合物8与文献报道的化合物波谱数据基本一致[32]，从而确定化合物8的结构为26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β,26-二羟基-(25R)-呋甾-5,20(22)-二烯-3-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)]-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，即zingiberenoside B。

2.10 化合物9

化合物9为白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰为m/z1083 [M + Na]+和1059 [M - H]-，结合化合物的13C NMR谱(200 MHz, C5D5N)数据推断其分子式为C52H84O22。通过2D NMR分析归属了化合物9的所有碳氢信号，苷元和糖基的碳谱数据见表1和表2，重要的1H NMR (800 MHz, C5D5N)信号如下：δH1.06 (s, H3-18), 0.72 (s, H3-19), 1.76 (d,J=6.0 Hz, H3-21), 1.16 (d,J= 6.5Hz, H3-27), 5.30 (br s, H-6), 4.95 (d,J= 7.0 Hz, Glc Ⅰ H-1), 4.85 (d,J= 7.5 Hz, Glc Ⅱ H-1), 5.92 (br s, Rha Ⅰ H-1)和6.43 (br s, Rha Ⅱ H-1)。化合物9的NMR数据与文献报道的化合物波谱数据基本一致[33]，从而确定化合物9为26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-15α-甲氧基-3β,26-二羟基-(25R)-呋甾-5,20-二烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.11 化合物10

化合物10为白色无定形粉末，Lieberman-Burchard和Molish反应呈阳性，表明该化合物可能是皂苷类化合物。ESI-MS显示其准分子离子峰为m/z1083 [M + Na]+和1059 [M - H]-，结合化合物的13C NMR谱(200 MHz, C5D5N)数据推断其分子式为C52H84O22。在1H NMR (800 MHz, C5D5N)谱的高场区中显示4个甲基氢信号δH0.88 (s), 1.06 (s), 1.42 (d,J= 7.2 Hz)和1.10 (br d,J= 6.3 Hz)，4个糖的端基氢信号4.97 (d,J= 7.0 Hz), 4.90 (d,J= 7.5 Hz,), 6.42 (br s)和5.88 (br s)。结合HSQC谱数据，发现4个甲基氢信号分别与δC13.9, 19.8, 15.6和17.90信号相关，4个端基氢信号分别与δC100.6, 105.3, 102.4和103.2相关。化合物10的13C NMR谱中显示1个甲氧基信号(δC49.2)，2个三取代双键信号(δC122.1和141.1; δC157.5和96.6)。化合物10酸水解的单糖衍生物经GC分析表明其糖基为D-Glc和L-Rha (2∶2)。通过2D NMR分析归属了化合物10的所有碳氢信号，苷元和糖基的碳谱数据见表1和表2。将化合物10的波谱数据与文献对照[34]，从而确定其结构为26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20-甲氧基-3β,26-二羟基-(25R)-呋甾-5,22-二烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，即dioscoreside E。

表1 从巴山重楼中分离的化合物1-10苷元部分的13C NMR数据 (200 MHz, C5D5N)

表2 从巴山重楼中分离到的化合物1-10糖基部分的13C NMR数据 (200 MHz, C5D5N)

续表

3 讨论

近年来，对重楼属植物化学成分和药理作用的研究越来越多，但主要集中在云南重楼和七叶一枝花两个药典品种上，而随着药典重楼市场需求的逐年增加，野生重楼资源日益枯竭，在加大人工种植的同时，寻找新的重楼替代资源成为了缓解资源危机的关键[35-36]。巴山重楼作为重楼属植物中重要的一员，其在土家族中广泛应用，但对其化学成分的研究不够充分，仅从中分离鉴定了19个甾体皂苷。本研究在本课题组前期提取分离的基础上，对巴山重楼70%乙醇提取物的正丁醇萃取部分进行了深入的研究，从中分离鉴定了10个甾体皂苷，除化合物1外，均首次从该种植物中分离得到，丰富了巴山重楼中甾体皂苷类成分的多样性。本研究为该植物的应用开发提供了化学成分基础，后续将开展该植物药理活性方面的研究，为其资源的进一步开发提供充足的科学依据。