安徽省部分地区淡水鱼华支睾吸虫感染状况调查分析

朱海，孙成松，汪奇志，呼明闯，章乐生，赵蕾，张世清

安徽省寄生虫病防治研究所，安徽 合肥 230601

食源性寄生虫病是指因生食或半生食含有感染期寄生虫的食物而感染的寄生虫病，其食物来源多半为肉类、鱼类、淡水甲壳动物、螺类以及植物等[1]。随着人们生活水平的提高及烹调方式的多元化，感染食源性寄生虫的人数逐渐增加[2]。华支睾吸虫是感染淡水鱼类的主要致病性寄生虫之一[3]，其成虫寄生于人体肝胆管内，可引起发热、胃痛、腹胀、食欲不振、四肢无力及肝区痛等症状，严重时可导致肝硬化、腹水，甚至诱发胆管癌[4]。因此，按照国家食品安全风险监测的有关要求，2019—2021年，安徽省寄生虫病防治研究所对安徽省部分地区淡水鱼华支睾吸虫感染情况开展了调查，现将调查结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 采样点选择 根据2016—2020年安徽省土源性线虫及华支睾吸虫感染监测情况[5]，选择安徽省马鞍山、宣城、淮南、淮北、阜阳和宿州6个市7个县的20个乡（镇、街道办事处）作为采样点。

1.2 样本采集

1.2.1 采样环节 采样环节包括养殖、流通及餐饮三个环节。其中，养殖环节主要是农村的淡水鱼养殖或野生鱼塘，流通环节主要是城区带有淡水鱼零售的超市、农贸市场、菜市场等，餐饮环节是不同档次或种类的就餐场所。

1.2.2 采样要求 在不同采样环节，每个采样地点每次采集中所获得某一种淡水鱼的总和即为1份样本。每份淡水鱼采样量不低于500 g。

1.2.3 采样时间 每年5月和8月各采集1次。

1.3 检测方法 每份样本进行消化后平分为2份，1份用于镜检法检测，1份提取DNA采用聚合酶链式反应（PCR法）及环介导等温扩增技术（LAMP法）检测。

1.3.1 样本消化 配制人工消化液，胃蛋白酶（Solarbio，货号：P8160）7.0 g，盐酸（36.5%～38.0%）10 mL，NaCl 12 g，加蒸馏水至1 000 mL，振荡混匀，放置15 min待用。将鱼剖杀后，刮去鳞片与皮，剪取若干条鱼的背鳍和尾鳍肌肉，称量50 g，加入少许人工消化液，用组织捣碎机低速匀浆后，转入500 mL烧杯中，按照1∶10比例添加人工消化液（每10 g样品加入100 mL消化液），充分搅拌后，37℃放置12 h或过夜，使样品充分消化。样本完全消化后，弃去浮渣与上清液，将全部沉渣经260目尼龙绢淘洗至水清，然后将沉渣转入培养皿中待检。

1.3.2 镜检法 吸取消化所得沉渣，在体视镜下观察，发现疑似囊蚴，吸取至载玻片上，于显微镜下进一步观察，根据其囊蚴的长、短径和囊壁厚度等形态学特征，鉴定囊蚴种属。

1.3.3 PCR法

1.3.3.1 样本DNA提取 用尼龙绢袋集卵法收集鱼肉样本沉渣，使用TIANamp Genomic DNA Kit（北京天根生化科技有限公司，编号：DP304）提取沉渣DNA，测定浓度后DNA样本-20℃保存备用。

1.3.3.2 引物设计 参考《鱼华支睾吸虫囊蚴鉴定方法》（SN/T 2975—2011）设计引物[6]，序列为CS1引物：5′-CGAGGGTCGGCTTATAAAC-3′；CS2引物：5′-GGAAAGTTAAGCACCGACC-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3.3 PCR扩增 反应总体系50μL，其中DNA模板5μL，20μmol/L引物（CS1/CS2）各0.1μL,10×PCR缓冲液5μL，MgCl2（25 mmol/L）5μL，dNTPs（25 mmol/L）1μL，Taq酶（5 U/μL）1μL。反应条件为94℃3 min，94℃40 s，62℃30 s，72℃30 s，共40个循环，最后72℃10 min，扩增产物4℃保存[7]。取6μL扩增产物和2μL样本缓冲液在2%琼脂糖平板上进行电泳，利用凝胶成像系统观察扩增产物并成像，目标产物长度为315 bp[8]。

1.3.4 LAMP法

1.3.4.1 样本来源 LAMP法检测所用样本同样为通过TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒提取的DNA样本。

1.3.4.2 引物设计 根据华支睾吸虫核糖体第二内转录间隔区（ITS2）基因序列设计引物体系，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成3对引物序列，分 别 为F3：TGCCTTATCCCGGGTACG；B3：AAACCCATGGCCGCAATA；FIP：GTGATCCACCGCTCAGAGTTGTACTGATAACGCCTCGGTCAT；BIP：CCGTGTGTCGATGAAGAGCGCATGCGTTC AAGATGTCGATGT；LF：CATCTCAATCAACTGGTAACCCAG；LB：TTAATGCGAACTGCATACTGCT[9]。

1.3.4.3 LAMP扩增 反应体系为25μL，反应条件为63～65℃，30～60 min。结果判断：阳参出现显色反应（反应管由黄色变为绿色）后，80℃10 min终止反应，观察其他标本是否有显色反应[9]。

1.4 结果判定 消化镜检法、PCR法、LAMP法任意一种检测阳性即判定为阳性样本。

2 结果

2.1 淡水鱼样本采集情况

2.1.1 采样点分布 2019—2021年共对39个淡水鱼华支睾吸虫采样点开展了调查。其中，2019年宿州市灵璧县采样点4个、马鞍山市和县11个；2020年马鞍山市当涂县3个、宣城市泾县3个、淮南市寿县6个、阜阳市太和县6个；2021年淮北市濉溪县6个。

2.1.2 样本种类及数量 2019—2021年分别采集了98、137、63份淡水鱼样本，共298份、51种。采集淡水鱼种类主要为黑鱼（27份，占9.06%）、鲢鱼（25份，占8.39%）、麦穗鱼（24份，占8.05%）、鳙鱼（24份，占8.05%）、草鱼（24份，占8.05%）、鳑鲏（23份，占7.72%）、黄颡鱼（23份，占7.72%）、餐条（22份，占7.38%）、棒花鱼（19份，占6.38%）、鲫鱼（19份，占6.38%）、鳅鱼（16份，占5.37%）、虾虎鱼（12份，占4.03%），其他不常见鱼种42份（占14.09%）。

2.1.3 各采样环节样本构成 养殖、流通和餐饮环节采样点数分别占35.90%（14/39）、35.90%（14/39）、28.21%（11/39）；采样份数分别占34.90%（104/298）、42.95%（128/298）和22.15%（66/298）。

2.2 淡水鱼华支睾吸虫检出情况 2019—2021年安徽省淡水鱼华支睾吸虫阳性份数检出率分别为8.16%（8/98）、3.65%（5/137）、7.93%（5/63），总阳性份数检出率为6.04%（18/298），见表1。2019—2021年消化镜检法阳性份数检出率为4.70%（14/298），PCR法和LAMP法检测出的阳性份数检出率均为6.04%（18/298）。消化镜检法检测为阳性的样本PCR法及LAMP法检测均为阳性，PCR法和LAMP法检测结果具有一致性，且通过双向测序验证确为华支睾吸虫DNA序列。

表1 不同检测方法华支睾吸虫检出情况

2.2.1 地区分布 2019—2021年安徽省调查的7个县中有6个县淡水鱼样本检出华支睾吸虫，39个采样点中有12个检出华支睾吸虫，各地淡水鱼华支睾吸虫检出情况见表2。

表2 不同调查地点淡水鱼华支睾吸虫检出情况

2.2.2 不同采样环节华支睾吸虫检出情况 养殖、流通及餐饮环节淡水鱼样本均检测出华支睾吸虫，阳性份数检出率分别为5.77%（6/104）、7.81%（10/128）、3.03%（2/66），三个采样环节间阳性份数检出率差异无统计学意义（χ2=1.775，P＞0.05），见表3。

表3 不同采样环节淡水鱼华支睾吸虫检出情况

2.2.3 不同鱼种华支睾吸虫检出情况 检出华支睾吸虫的淡水鱼有6种，分别为麦穗鱼、餐条、棒花鱼、虾虎鱼、鳑鲏、草鱼，见表4。麦穗鱼、餐条、棒花鱼等小型鱼种共采样140份，阳性17份，阳性份数检出率为12.14%；其他大型鱼种采样158份，阳性1份，阳性份数检出率为0.60%，两者阳性份数检出率差异有统计学意义（χ2=17.327，P＜0.05）。

表4 不同淡水鱼种华支睾吸虫检出情况

3 讨论

华支睾吸虫病是我国流行较为严重的食源性寄生虫病之一，90%以上的华支睾吸虫感染者分布于广东、广西、黑龙江和吉林等省份[10-11]。安徽省是我国华支睾吸虫感染率相对偏低的省份，2015年第三次全国人体重点寄生虫病调查结果显示全省华支睾吸虫感染率为0.01%[10]，2016—2020年安徽省人体华支睾吸虫感染监测结果显示全省5年总感染率为0.04%[5]。

华支睾吸虫病的防治不仅需要对人群感染情况进行监测，还需要加强对其中间宿主感染情况的监测。2019—2021年安徽省淡水鱼寄生虫感染监测结果显示，安徽省淡水鱼华支睾吸虫阳性份数检出率为6.04%。安徽省的调查覆盖了养殖、流通及餐饮多个环节，并采用病原学与分子生物学进行平行检测。本研究采用了LAMP检测方法[9]，并将其与消化镜检法及PCR方法结合用于现场平行检测。这种检测方法，不仅克服了消化镜检法中形态学特征不易判定，容易漏检的缺点；又弥补了PCR方法中样本DNA浓度可能达不到检测要求的不足[12]。在今后的淡水鱼华支睾吸虫监测工作中，可将LAMP法作为常规消化镜检法的重要补充，以满足淡水鱼华支睾吸虫感染情况监测工作的要求[13]，提高华支睾吸虫的检出率。

本调查显示，7个县中6个县存在淡水鱼华支睾吸虫感染，其中以当涂县淡水鱼的阳性占比最高，这可能与该县的淡水养殖业发达有关。在本次采样过程中，养殖环节的采样点多选择野生或半野生环境的养殖水面，流通及餐饮环节的采样点则多选择与养殖环节采样点存在供应关系的农贸市场和餐饮点，这可能是各环节均检出华支睾吸虫的原因之一。在采集到的51个鱼种中，共有6种鱼存在华支睾吸虫感染，除在寿县捕获的草鱼为大型鱼种外，其余都是麦穗鱼、棒花鱼等小型鱼种，其中麦穗鱼的阳性份数检出率高达33.33%，这可能与小型鱼种的主要栖息区域更靠近华支睾吸虫中间宿主淡水螺的孳生区域，更易受华支睾吸虫尾蚴感染有关。

尽管安徽省不是我国华支睾吸虫病高度流行区，但监测结果显示目前安徽省部分地区淡水鱼华支睾吸虫感染情况仍处于较高水平，并具有点多面广的特征，提示人群感染华支睾吸虫的风险较大。因此，应重视鱼源性寄生虫病的防控工作，加强对野生鱼塘的管理，以及淡水鱼养殖及流通环节管理，做好淡水鱼溯源及检测。同时，还需加强食品安全的宣传教育，促进人群养成良好的饮食习惯。此外，还需进一步加大监测范围，为安徽省华支睾吸虫病等鱼源性寄生虫病的防控提供依据。