基质金属蛋白酶抑制剂在糖尿病视网膜病变的研究进展

朱素华，徐圣秋

(徐州市第一人民医院 药学部，江苏 徐州 221000)

糖尿病是世界上常见的代谢性疾病之一，对人类的健康产生了重大威胁，预计到2045年全球20～79岁人群中有7.83亿人患病[1]。糖尿病并发症较多，包括微血管并发症和大血管并发症，其中微血管并发症包括糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、糖尿病肾病、糖尿病性神经病变，大血管并发症包括缺血性心脏病、周围血管病、脑血管疾病[2]。

DR是糖尿病严重的微血管并发症之一，全世界范围内约有420万患者因此失明，且人数在逐年增加[3]。氧化应激、炎症、遗传因素、晚期糖基化终产物形成增多、多元醇途径的激活和蛋白激酶C可能在DR的发病机制中发挥着重要作用，但是确切的机制尚不清楚[4-5]。在增殖期，上述机制均可引起血管通透性增加、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)分泌增多[6-7]。视网膜、视神经和虹膜上新生血管生成，新生血管较脆，易发生视网膜出血。此外，渗漏导致的视网膜下间隙积液可能导致黄斑水肿，进而引起视网膜脱离。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是锌依赖性的明胶酶，在细胞外基质中被激活，从而水解大部分细胞外基质蛋白酶[8-9]。多数MMPs由非活性的酶原分泌，然后被纤溶酶切割成活性形式[10]。尽管早在20世纪60年代人们就开始研究MMPs在细胞外基质中的蛋白水解活性[11]，但近年来，世界范围内的许多医学研究者才开始对MMPs的研究越来越重视。事实上，除了降解各种细胞外蛋白，MMPs还能在外界环境刺激下激活和抑制信号通路相关分子的表达，导致细胞内的变化。其中一些还参与各种激素和信号分子的激活和失活。尽管如此，MMPs的作用逐渐被发现，被证明与癌症、动脉粥样硬化、炎症性肠病、阿尔茨海默病、衰老及DR有关[12-15]。MMPs的具体功能一直备受关注，在DR中的具体机制有待进一步研究。本文通过对MMPs在DR中的研究现状、 MMPs种类、针对MMPs靶点的新疗法进行综述，旨在为以MMPs为靶点的DR新疗法在临床上的应用提供依据。

1 MMPs在DR中的研究现状

在DR中，MMPs的平衡遭到破坏[16]。由于MMPs是细胞外基质降解的主要决定因素，它们在视网膜病变中的作用是非常重要的。MMPs通过降解维持血视网膜屏障(blood retinal barrier，BRB)完整性的连接蛋白、紧密连接蛋白、钙粘着蛋白来增加血管通透性。MMP-2和MMP-9因能够降解基底膜，一直备受关注。此外，它们在新生血管形成中也起着重要作用。研究发现，在糖尿病大鼠造模12周时，视网膜组织中MMP-9、MMP-2、MMP-14 mRNA水平升高，在高糖环境刺激下，视网膜内皮细胞MMP-9表达增加[17]。Liu等[18]进一步研究发现，糖尿病动物视网膜组织中MMP-2和MMP-9表达增加。此外，他们还证实BB-94(一种TIMPs )能够有效抑制视网膜血管通透性，证实MMP在BRB中发挥着重要作用。Gaonkar等[19]在增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者的玻璃体中检测出MMP-9，可能与玻璃体出血有关。随后，有研究报道MMP-9的调节依赖于血管紧张素Ⅱ和VEGF[20]。因此，PDR视网膜中ACE依赖性血管紧张素II和VEGF的生成可能与MMP-9浓度的升高有关。进一步研究表明，MMP-9在细胞凋亡中发挥重要作用，刺激细胞VEGF的分泌[7]，研究者还发现在PDR患者中，MMP-9活性增加可能导致组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)表达降低。根据动物研究数据，TFPI可能抑制血管生成[7]。2018年，Abu El-Asrar等[21]再次证明PDR患者玻璃体内MMP-9与VEGF呈正相关，同时研究了4种金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)的表达情况，结果发现，在PDR患者玻璃体内TIMP-1和TIMP-4水平升高，并与MMP-9和VEGF水平呈正相关。此外，Abu EI-Asrar等[22]在PDR患者的玻璃体标本中发现了MMP-1；相反，在正常人样本中没有发现MMP-1。玻璃体内MMP-1与VEGF水平呈正相关。这表明凝血酶/MMP-1/蛋白酶活化受体-1通路可能参与缺血诱导PDR的血管生成。因此，深入了解TIMPs的作用对于研究以MMPs和TIMPs为靶点的新药物必不可少。

2 TIMPs种类

TIMPs作为一种内源性抑制剂，能够以特定的方式与MMPs结合，抑制MMPs的活化。到目前为止，已经发现4种TIMPs，分别是TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4[23]。所有的TIMPs具有相似的功能，但也存在一些特异性差异。TIMP-2对MMP-2的抑制作用是TIMP-1的2～10倍。然而，与TIMP-2和TIMP- 3不同的是，TIMP-1不能有效降解膜型MMPs(MT-MMPs)。TIMPs以1∶1的比例与相应的MMPs结合，因此MMPs和TIMPs浓度间的平衡在不同疾病中需要精确调节[23]。对于慢性炎症，糖尿病患者血浆和组织样本中的MMPs浓度可能更高。MMPs和TIMPs浓度并不一致[21, 24]。在大多数情况下MMP/TIMP比例升高[25-26]。此现象发生在各种病理状态下，包括慢性糖尿病并发症[24]。另一方面，当患者伴有糖尿病并发症时，MMP活性增加。这种情况出现在糖尿病肾病可能与TIMP-2活性相关的糖基化水平的升高有关。

目前，研究最广泛的是TIMP-1，TIMP-1可能预防1型糖尿病的发生。与之相对应的动物研究发现，糖尿病小猪血浆中TIMP-1的升高与其心脏纤维化、左心室肥厚增加及心脏功能障碍密切相关[27]。TIMP-1抑制MMP-9活性，引起细胞毒性T细胞迁移到胰岛中的细胞减少，进而减少细胞凋亡，这可能是未来糖尿病具有潜力的治疗靶点之一。

3 针对MMPs靶点的新疗法

3.1目前DR的治疗方法 由于DR是糖尿病的一个重要并发症，且危害巨大，因此早期诊断和治疗显得十分重要。目前DR的治疗手段有：①玻璃体内注射抗VEGF药物(如雷珠单抗、康柏西普、阿柏西普、贝伐珠单抗)、抗炎药皮质类固醇(如曲安奈德、地塞米松缓释剂)，传统的激光光凝术和新型扫描式光凝治疗；②其他治疗药物：心磷脂靶向肽、α-硫辛酸、叶黄素、达普拉缔等。上述治疗方法效果比较肯定，可作为评价其他治疗方法有效性的参考[28]。然而这些治疗方法具有一定的局限性，寻求新的替代治疗十分必要[29]。

3.2TIMPs 现在大部分国内外研究主要针对与视力损害有关的糖尿病性黄斑水肿和PDR。目前最常见的研究靶点是MMP-2、MMP-9和VEGF，因为它们在视网膜病变的发展中起着至关重要的作用。历史上第一个人工合成的TIMPs被用于治疗癌症。早在20世纪90年代研究者就发现肿瘤生长、血管再生与MMPs表达有重要联系。TIMPs被认为是治疗癌症的一个重大突破，然而TIMPs可能会对正常组织中的MMP发挥作用。此外这些药物的生物利用度低、不良反应大，在临床靶向治疗癌症的使用中受到限制。但是相关研究还在继续，研究者们正在关注下一代新型TIMPs和其他疾病。

2002年，一种新型的选择性MMP-9和MMP-2抑制剂普马司他(AG3340)被证实在动物模型中能够显著抑制氧化应激进而减少视网膜新生血管形成，可能是治疗DR的潜在药物[30]。2007年，Barnett等[31]在氧诱导视网膜病变的动物模型上检测了3种具有不同选择性的TIMPs：RO-31-9790(广谱抑制剂)、AG3340(选择性MMP-2和MMP-9抑制剂)和DPC-A37668(选择性MMP-2抑制剂)。所有药物均经玻璃体腔注射给药，AG3340和DPC-A37668也经口服和腹腔给药。玻璃体内注射这3种药物后新生血管形成的面积均减少，但只有注射RO-31-9790的动物模型新生血管生成面积减少显著。其他药物抗血管生成的作用可能与注射造成的伤口愈合有关。与对照组相比，DPC-A37668确实使新生血管生成显著减少，但仅在口服时效果显著。DPC-A37668是所有实验抑制剂中最有潜力的药物，因为它的给药途径风险最小。Bhatt等[32]研究发现，阿司匹林(一种非选择性COX抑制剂)能增强米诺环素抑制MMP-2和MMP-9的作用。

3.3MMPs的转录调节因子 早期的研究主要集中在与MMP活性位点结合的螯合锌离子的抑制剂上[33]。现在，研究者逐渐开始研究其他更复杂的调节MMPs表达的方法。2013年，一个研究小组试图检测细胞外信号调节激酶-1/2(extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)抑制剂(U0126)对糖尿病大鼠视网膜MMP-9和TIMP-1表达的影响。研究者在实验中采用链脲佐菌素(STZ)造模，将动物分为3组：正常组、未注射抑制剂的糖尿病组和注射U0126的糖尿病组。与正常组相比，未注射抑制剂的糖尿病组视网膜组织ERK1/2活性和MMP-9表达显著升高，TIMP-1表达降低；与未注射抑制剂的糖尿病组相比注射U0126的糖尿病组ERK1/2活性和MMP-9表达均降低，同时TIMP-1水平升高；注射U0126的糖尿病组与正常组实验结果相似[34]。

另一方面，Mishra等[35]研究了聚ADP核糖聚合酶-1对调节MMP-9基因表达的转录因子的影响。聚ADP核糖聚合酶-1与相应的转录因子结合，促进转录过程。聚ADP核糖聚合酶-1活性的增加与MMP-9水平的升高和细胞损伤有关。在细胞实验中，与正常糖培养的细胞组相比，高糖刺激组细胞MMP-9表达和聚ADP核糖聚合酶-1活性明显升高，在给与聚ADP核糖聚合酶-1抑制剂的高糖细胞组没有出现这种现象，这一实验结果在小鼠实验中也得到证实。因此，转录调节因子聚ADP核糖聚合酶-1抑制剂为DR的治疗提供了新方向。

3.4植物性天然化合物 研究表明一些天然和植物性物质可调节MMPs活性。Olanlokun等[36]对姜黄中提取的姜黄素进行了研究分析，发现姜黄素能够调节MMPs活性，但姜黄素具有非特异性，生物利用度低。然而未来可能可以把姜黄素设计成选择性高和生物利用度更高的药物。Alparslan等[37]对从蜂胶中提取的咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)进行了研究，与模型组相比，CAPE治疗组MMP-2、MMP-9的表达水平降低、氧化应激损伤减少。陈晶等[38]研究发现，青蒿琥酯治疗使STZ诱导的大鼠组MMP-9 mRNA表达水平明显降低，TIMP-1 mRNA 表达水平显著升高。对天然化合物的深入研究，有助于DR的治疗。

3.5靶向微小RNA (microRNA, miRNA)治疗 多年来，基因治疗DR对研究者们一直有很大的诱惑力。随着对DR潜在的遗传机制和表观遗传修饰认识的不断提高，这种治疗DR的方法不断地被研究。miRNA是一种短链非编码RNA，与基因表达的转录后调控有关，与一些DR新的治疗方法有关[39]。值得注意的是，血清miRNA-126和miRNA-132的水平可作为PDR的早期标志物[40]。有研究指出miRNA-365通过抑制TIMP-3在DR发病机制中发挥重要作用[41]。Yang等[42]研究发现，miRNA-15b可能通过靶向3'-UTR区域抑制VEGF基因转录来调控其表达，进而抑制PDR的发展。有研究证实，在高糖诱导的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells，RPEs)中，miR-200a-3p的过表达抑制细胞凋亡、MMP-2/MMP-9活性和VEGF表达，可阻止DR的发展[43]。尽管大量基于miRNA的化合物已经被研究，但其中只有少数进入了临床开发阶段。由于miRNA与几乎所有的生理、病理过程密切相关，因此基于miRNA的构建物具有巨大的治疗潜力。

3.6MMPs基因表达的靶向表观遗传调控 Kowluru等[44]研究发现，编码MMP-9和线粒体超氧化物歧化酶的基因可以在糖尿病环境中进行表观遗传修饰。接下来的研究发现，DNA甲基化在糖尿病视网膜MMP-9的转录调控中起着关键作用[45]。糖尿病患者氧化应激损伤增加，调节DNA甲基化，调节氧化应激抑制MMP-9的激活，可避免DR进一步恶化[46]。2020年又有了新的突破，研究发现，同型半胱氨酸通过减少TIMP-1与MMP-9的相互作用，减少MMP-9激活，调节DNA甲基化，减缓DR的进展[47]。深入了解氧化应激损伤的过程，有助于治疗DR。

4 小结与展望

由于人类寿命的延长和糖尿病患病率的增加，DR使医学界面临巨大的挑战。氧化应激损伤、炎症、遗传因素、晚期糖基化终产物形成增加、多元醇途径的激活和蛋白激酶C可能在DR的发病机制中发挥着重要作用，以MMPs为治疗靶点是目前研究的热点。MMPs调节多个信号通路，参与DR的发病。目前治疗DR的方法很多，但存在一定的局限性。TIMPs可作为DR的潜在治疗方法，但需要对TIMP/MMP靶向系统有更详细的了解，尤其是在生物学和疾病过程中的相互作用。然而，TIMP和MMPs的平衡关系及具体机制有待进一步研究，以更好地应用于DR治疗。