Nrf2及其通路在脓毒症相关性脑病中的研究进展

孟小舟综述，张利东审校

0 引 言

大脑在脓毒症期间耗氧量高，抗氧化、抗炎能力差，中枢神经系统易受到氧化和炎症过程介导的损伤，因此高达70%的脓毒症患者会进展至脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalopathy, SAE)。SAE不仅会增加死亡率和住院时间，还可能导致长期的身体和认知损伤，包括注意力、处理速度、联想学习、视觉感知、工作记忆和语言记忆障碍[1]。据报道氧化应激、神经炎症、神经元凋亡、血脑屏障完整性损伤或脑微循环障碍、氨基酸或神经递质异常、线粒体功能障碍、肠道菌群移位等多种因素参与了SAE的发病机制，但具体机制尚未确定[2]。这些因素均可导致脑组织微环境的改变，进而增加海马神经元兴奋性毒性损伤引起认知功能障碍[3]。SAE的传统临床干预手段如使用抗菌药物简单且有限，效果差，预后差，目前研究证实通过抗氧化、抗炎等途径可改善SAE患者的预后和认知功能。核转录因子-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)是调节哺乳动物的抗氧化反应和Ⅱ期解毒反应的重要转录因子，负责维持细胞氧化还原平衡。既往研究发现Nrf2作为最重要的内源性抗氧化因子，在多种神经退行性疾病中通过提高抗氧化防御能力发挥神经保护作用[4]。现有研究表明Nrf2在SAE中介导抗氧化、抗炎等机制减轻SAE的脑损伤，改善SAE的预后和认知功能。深入研究Nrf2在SAE中的作用和调节机制，可为SAE的治疗寻找新的干预靶点，有利于研发治疗SAE的新型药物。

1 SAE相关氧化应激机制

SAE的病理生理学是复杂和多因素的，包括许多相互交织的机制，如氧化应激、神经炎症、神经元凋亡、血脑屏障完整性损伤和线粒体功能障碍等。其中，氧化应激(oxidative stress, OS)诱导的神经元凋亡在SAE的发病和进展中起着至关重要的作用，是大脑功能障碍的主要原因。氧化应激是全身炎症反应的主要促进剂和介质，可导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)的大量产生和氧化因子、促炎因子的增加以及抗氧化系统的抑制，引起内质网应激、线粒体功能障碍、脑细胞钙稳态破坏，影响神经胶质细胞、神经元和BBB的正常结构和功能，这在很大程度上导致与SAE相关的脑损伤和认知损伤，甚至导致SAE患者预后差以及死亡率增加[5]。除既往研究的MDA、SOD等氧化指标，临床研究还发现SAE患者血浆和CSF中的抗坏血酸水平均显著低于正常人，而CSF中抗坏血酸水平与神经系统症状的严重程度相关。而动物实验揭示了GRK2、Ngb蛋白可能成为具有潜力的防治SAE的靶点，这些研究都表明抗氧化可能是治疗SAE的有效途径[6]。人体已进化出一个复杂的OS反应系统，在ROS作用下可诱导一系列保护蛋白来减轻氧化损伤，Nrf2/ARE是迄今为止发现的最重要的内源性抗OS信号通路，提示我们Nrf2有潜力预防或减轻氧化应激对SAE的影响。

2 Nrf2概述

Moi等[7]首先将Nrf2描述为β-珠蛋白基因表达的激活剂，后来将其描述为细胞内氧化应激的主要传感器。Nrf2由7个具有不同功能的结构域组成[8]。Neh1结构域负责与小肌肉腱膜性纤维肉瘤蛋白(small musculoaponeurotic fibrosarcoma，sMaf)的结合和二聚以及核定位信号(nuclear localization signal，NLS)的调控，以增强Nrf2转录活性。Neh2结构域介导ETGE和DLG两种基序结合Keap1调控Nrf2稳定性。Neh3、Neh4和Neh5结构域结合CREB结合蛋白CBP，增强Nrf2转录活性，Neh5结构域还负责调控Nrf2的细胞定位。Neh6结构域调控非Keap1依赖性的Nrf2降解，并结合β-转导重复相容蛋白(β-TrCP)调控Nrf2稳定性。Neh7结构域直接结合Nrf2的抑制因子维甲酸X受体α(RXRα)，抑制Nrf2转录活性。Neh1-Neh7结构域共同构成Nrf2的结构基础，调控数百个参与抗氧化反应的下游基因，包括抗氧化酶和Ⅱ期解毒酶。Nrf2在神经退行性疾病中上调抗氧化酶的表达、抑制神经胶质细胞介导的炎症反应以及改善线粒体功能，提示Nrf2是一种靶向神经退行性疾病认知功能的治疗途径[9]。随着对Nrf2的深入研究，发现Nrf2可参与调节未折叠蛋白反应、调节蛋白酶体活性、调节干细胞的增殖和分化等过程，提示Nrf2在中枢神经系统领域具有广阔的研究前景。

3 Nrf2在SAE中的作用

SAE后脑组织中ROS和促炎因子增加，造成血管内皮细胞线粒体氧化应激和细胞凋亡，导致ROS和促炎因子进入脑组织中诱发神经元损伤，进而造成认知功能障碍。维持机体氧化还原平衡和恢复稳态的主要机制是Nrf2途径，而Nrf2活性随年龄的增长而下降是SAE的主要危险因素之一。Nrf2可减轻氧化应激损伤，并提高脑神经元存活率，保护人类或啮齿动物来源的星形胶质细胞。敲除Nrf2导致SAE小胶质细胞和星形胶质细胞的海马反应性胶质细胞增生增加，改变脑组织微环境和影响神经元结构和功能造成脑损伤导致认知功能障碍[10]。而激活Nrf2可上调抗氧化防御反应、降低炎症反应、改善线粒体功能和维持蛋白质稳态来改善认知损伤[11]。研究发现Nrf2敲除小鼠易受LPS诱导的急性炎症攻击，而激活Nrf2可保护被LPS攻击的小鼠免于死亡。陈锋等[12]报道在LPS诱导SAE大鼠脑内氧化损伤过程中，脑组织中Nrf2 mRNA水平、Nrf2总蛋白水平以及p-Nrf2水平都显著升高，同时上述水平的变化均与LPS具有剂量相关性，提示Nrf2以总蛋白水平与磷酸化水平两种形式参与SAE氧化过程。所以，Nrf2可能通过增加mRNA和蛋白表达减轻SAE氧化损伤和认知损伤。

4 Nrf2相关信号通路对SAE的调节机制

4.1 Keap1/Nrf2/ARE通路Kelch样ECH关联蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)是一种富含半胱氨酸巯基的氧化还原损伤传感器，已知锚定在肌动蛋白细胞骨架。Keap1与Nrf2相互抑制，在正常条件下，Keap1负调控 Nrf2并最终降解Nrf2。在氧化应激环境下，Nrf2因Keap1构象变化而与Keap1分离，并从细胞质易位到细胞核中与sMaf蛋白或转录因子C-JUN和JUND异源二聚化。异二聚体识别并结合ARE调节一系列编码抗氧化酶、解毒酶、代谢改变酶和应激反应蛋白酶的表达，发挥抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗钙超载等多种功能，在神经退行性疾病中发挥神经保护作用[4]。Keap1/Nrf2通路的分子激活和细胞保护活性由四个不同但相互关联的成分组成：①Nrf2活性的化学激活剂；②这些激活剂的蛋白传感器Keap1；③转录因子Nrf2调节对激活剂和氧化应激的转录反应；④提供该途径的细胞保护输出的靶基因。Keap1/Nrf2/ARE通路是机体最重要的抗氧化通路，是治疗氧化应激和神经炎症相关疾病的关键靶点。Cui等[13]证实GYY4137通过keap1的活化激活Nrf2/ARE通路，并在SAE小鼠体内发挥抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，从而保护血脑屏障的完整性，改善SAE的预后。ML385作为Nrf2抑制剂可直接结合到Nrf2的Neh1结构域，降低Nrf2转录活性，通过抑制抗氧化酶上调和增加凋亡蛋白表达逆转了Nrf2/ARE通路对SAE小鼠的保护作用。因此Keap1/Nrf2/ARE通路作为预防和治疗SAE的潜在靶点，在SAE中发挥着至关重要的神经保护作用。

4.1.1 Nrf2/HO-1通路血红素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)是一种具有细胞保护作用的抗氧化酶，可通过调节氧化损伤、减轻炎症反应、拮抗细胞凋亡和促进血管生成而发挥神经保护作用[14]。Nrf2增加mRNA和蛋白表达诱导激活HO-1，神经元中HO-1增强了神经营养因子的上调，可以抵抗各种形式的细胞死亡,包括坏死、凋亡和新近发现的调节性细胞死亡(RCD)。Zakaria等[15]在LPS诱导SAE小鼠模型中发现LPS诱导 HO-1 mRNA 表达轻微增强，Ho-1酶活性下降，研究认为吡格列酮通过增强HO-1 mRNA的表达和恢复HO-1酶活性可改善LPS诱导的多巴胺能神经元丢失和神经行为障碍。Tang等[16]发现Nrf2/HO-1通路不仅可通过减少ROS的生成来发挥抗氧化保护作用，还可促使巨噬细胞/小胶质细胞从促炎M1表型到抗炎M2表型的极化，显著降低促炎因子表达。Zhang等[11]在CLP诱导SAE大鼠模型中发现，维生素C增加海马核和总Nrf2和 HO-1的表达，显著降低血清及海马中的TNF-α、IL-6、MDA含量以及海马中的MMP-9活性，显著升高血清及海马中的SOD、IL-10浓度，提示靶向Nrf2/HO-1通路可减轻海马组织病理改变，减轻全身炎症和神经炎症，改善血脑屏障通透性，抑制脑组织氧化应激来改善SAE认知功能。以上研究表明HO-1作为Nrf2下游蛋白可为SAE认知功能提供一种治疗靶点。

4.1.2 Nrf2/GPX4通路谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)是生物抗氧化系统中抗氧化酶类的重要成员，可利用谷胱甘肽(glutathione，r-glutamyl cysteingl +glycine，GSH)的还原形式作为电子供体抑制脂质过氧化来减少氧化损伤。Ingond等[17]发现敲除GPX4会导致小鼠胚胎死亡，而表达低酶活性突变GPX4的小鼠在出生后第18天死于大脑过度氧化应激，表明GPX4对于防止氧化应激介导的神经元损伤至关重要。GPX4在细菌感染和多微生物脓毒症中具有保护作用，可能成为开发有效控制感染和脓毒症药物的关键分子靶点。Kang等[18]发现GPX4及其减少脂质过氧化的能力对于小鼠巨噬细胞焦亡和脓毒症致死率具有负性调节作用。这项研究首次揭示了GPX4通过抑制细胞焦亡在脓毒症中的保护作用，这为开发有效的靶向脂质过氧化和促进GPX4活性治疗脓毒症奠定了基础。Nrf2调控多种氧化基因的转录,这些基因参与了GPX4-GSH介导的铁死亡防御。铁死亡是一种由GSH合成中断或GPX4抑制引起的细胞死亡机制，并伴随着ROS的表达升高和线粒体功能障碍。姚鹏等[19]在LPS诱导SAE大鼠模型中发现Def组相比SAE组，海马Nrf2、GPX4表达及血清铁含量显著增加，海马NOX1、MDA、铁含量及血清IL-6、NSE含量明显降低，表明激活Nrf2/GPX4通路可降低大鼠海马区铁沉积和氧化应激水平，减轻神经元退行性变，明显改善认知功能。以上结果表明Nrf2通过促进GPX4活性抑制氧化应激和铁死亡并改善SAE相关神经元损伤。

4.2 Nrf2/NF-κB通路核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)调节ROS和促炎因子(细胞粘附分子1、IL-1β、IL-6、TNF-α等)的表达，因此可认为NF-κB启动了脓毒症炎症级联反应。Nrf2负调节NF-κB，Nrf2通过抗氧化反应降低细胞中ROS的表达减弱NF-κB的表达。NF-κB p65亚单位通过与CBP的CH1-KIX结构域或局部组蛋白低乙酰化的竞争性相互作用，在转录水平上抑制Nrf2。Pan等[20]首次证明Nrf2和NF-κB之间相互作用，研究发现敲除Nrf2小鼠的星形胶质细胞的培养能够增强依赖于经典的NF-κB通路的促炎因子的产生，这些促炎介质的过表达导致过多星形胶质细胞死亡加重脑损伤。Chen等[21]在CLP诱导SAE大鼠模型中发现SAE激活了Nrf2的表达，H2进一步增强了Nrf2的表达。H2可减轻SAE小鼠M1至M2表型的小胶质细胞/巨噬细胞极化，并减轻大脑皮层促炎因子的释放，改善神经元损伤和认知功能，但Nrf2敲除小鼠没有这种神经保护作用。P65是NF-κB异二聚体的亚单位，诱导NLRP3和IL-1β的转录。P65/NF-κB通过与NLRP3相互作用，在LPS刺激后诱导NLRP3的激活，而NF-κB抑制剂可显著降低NLRP3的激活[22]。这项研究表明Nrf2/NF-κB通路与Nrf2/NLRP3通路协同作用共同参与调控SAE认知功能。

4.3 Nrf2/NLRP3通路NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)是脑损伤中含量最丰富的炎症体，NLRP3激活caspase-1将前IL-1β转化为生物活性IL-1β，从而启动局部炎症反应。炎症反应促进ROS释放，ROS作用于NLRP3的上游，并直接或间接地通过MAPK/NF-κB通路激活NLRP3活性，而LPS结合TLR4或感知病原体相关的分子模式增强NLRP3启动和激活NLRP3炎症体组装来增强促炎反应[23]。Xie等[24]在CLP诱导SAE小鼠模型中发现SAE组小胶质细胞Nrf2和NLRP3的表达增加，MCC950作为NLRP3抑制剂可抑制SAE诱导的NLRP3的表达，减少IL-1β和IL-18的释放以及改善神经元和线粒体功能。H2增加Nrf2的表达，抑制NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表达，减轻炎症反应、神经元凋亡和线粒体功能障碍改善认知损伤，而Nrf2敲除小鼠则没有这种神经保护作用。但炎症体的异常激活与蛋白质错误折叠疾病有关，因此在将Nrf2作为SAE治疗靶点之前，进一步研究Nrf2激活炎症体功能的机制非常重要。

4.4 GSK-3β/Nrf2通路糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是调控非Keap1依赖性Nrf2稳定性的关键蛋白。GSK-3β介导DSGIS基序磷酸化后，Nrf2的Neh6结构域有效结合β-TrCP促进Nrf2蛋白酶体降解。GSK-3β可磷酸化Fyn，Fyn在病理条件下通过磷酸化、核输出和蛋白酶体降解调节Nrf2表达。Zhu等[25]在LPS诱导SAE大鼠模型中发现异甘草素增加海马突触素、PSD-95、BDNF、SOD、GSH和BCL-2的表达,降低BAX、IL-1β、IL-6、TNF-α和C-C基序趋化因子配体3的表达，表明GSK-3β/Nrf2通路可能通过磷酸化依赖性失活GSK-3β，增强Nrf2反应性抗氧化酶和抑制NF-κB反应性促炎因子的表达，保护LPS诱导的神经元损伤和认知损伤。

4.5 SIRT1/Nrf2通路沉默调节蛋白1(Sirtuin 1，SIRT1)广泛表达于中枢神经系统，催化非组蛋白和组蛋白脱乙酰化来调节基因表达，参与脑生理功能的维持，表现出神经保护和抗炎作用。Xu等[26]在LPS诱导SAE大鼠模型中认为SIRT1可能是认知功能潜在的作用靶点。研究发现红景天苷增加Sirt1、Nrf2的表达，上调SOD浓度，增加Bcl-2的表达，下调MDA活性，降低Bax、caspase-3和caspase-9的表达，表明SIRT1/Nrf2通路通过SIRT1激活Nrf2依赖性的抗氧化和抗炎活性来改善LPS引起的脑炎症性损伤和认知损伤。

4.6 其他据报道Nrf2改善SAE认知功能的途径还包括Nrf2/AQP4、PI3K/Akt/Nrf2等通路。Liu等[10]研究表明敲除Nrf2促进LPS诱导的AQP4表达增加，加重小鼠认知功能障碍；敲除AQP4可减少LPS诱导的神经炎症改善小鼠认知功能，为SAE潜在的Nrf2/AQP4机制提供了证据。Liao等[27]研究发现丹参素冰片酯激活PI3K/Akt/Nrf2通路，诱导Nrf2和抗氧化酶表达均伴随p-PI3K、p-Akt水平升高，改善LPS诱导的SAE认知损伤。以上Nrf2通路并非单独存在，而是互相作用共同改善SAE预后和认知功能。Nrf2在SAE中的具体调节机制复杂，仍需要我们进一步研究探索。

5 Nrf2激活剂

5.1 动物实验研究目前研究发现有不少药物可治疗啮齿动物SAE，如富马酸二甲酯、白藜芦醇、姜黄素等传统的Nrf2激活剂。在SAE模型中使用这些抗氧化剂介导Nrf2的激活，提高啮齿动物的存活率，减轻多器官损伤和认知损伤。不同于传统的Nrf2激活剂，Keap1-Nrf2 PPI抑制剂已成为激活Nrf2的一种新方法，可通过非共价相互作用竞争性地直接破坏Keap1-Nrf2 PPI，成为治疗SAE的潜在药物来改善认知功能。MSC外泌体是中枢神经系统疾病的强效抗炎纳米治疗剂[28]，MSC外泌体在体内外均能与海马星形胶质细胞结合，减轻炎症反应，改善LPS诱导的线粒体功能障碍[29]，表明外泌体可能作为Nrf2激活剂改善SAE认知功能。MSC外泌体因其高安全性和多靶点效应，使其在脓毒症及认知功能障碍的治疗中引起广泛的研究兴趣。Nrf2在SAE动物模型中的作用及其机制的研究为临床研究提供理论依据，有利于研发新型高效的Nrf2激活剂，但Nrf2激活剂或与其它治疗SAE药物结合的临床疗效需要进一步通过临床研究来确定。

5.2 临床研究目前许多传统的Nrf2激活剂正在进行临床研究，如DMF、SFN、CDDO-Me、Oltipraz，且Keap1-Nrf2 PPI抑制剂的研发也已取得显著进展。目前Nrf2激活剂有以下问题亟待解决[30]:①亲电Nrf2激活剂的潜在缺陷是会与除Keap1外的蛋白质中的氧化还原敏感半胱氨酸发生反应表现出脱靶效应，表现为对Keap1的选择性可能不高，因此应研发具备靶向选择性的Nrf2激活剂；②大多数Keap1-Nrf2 PPI抑制剂含有极性基团，通常导致血脑屏障穿透性差，如何提高体内疗效和穿透血脑屏障到达中枢神经系统是一个挑战；③Nrf2可能是癌症进展、转移和耐药性的驱动因素。应用Nrf2激活剂来对抗炎症可能会导致Nrf2下游基因的异常表达，从而诱导肿瘤发生和对放化疗的抵抗。由于在脓毒症治疗中仅急性使用Nrf2激活剂，所以Nrf2的致癌潜力可以忽略不计。因此应开发高度特异性的Nrf2激活剂，以尽量减少其多效性效应。目前还没有关于Nrf2激活剂在SAE患者中的临床试验[31]，因此需要Nrf2在SAE领域的临床前和临床研究。

6 结 语

深入研究发现Nrf2在SAE中的作用越来越突出，未来研究目标是研究Nrf2在SAE中的具体调节机制，将Nrf2及其下游靶蛋白的表达水平作为预测和诊断SAE的指标。此外，针对Nrf2相关通路的靶点研发药物治疗SAE患者具有广阔的临床应用前景。当前SAE研究面临高度异质性和难以转化为临床实践的困境，而新冠肺炎的研究涉及Nrf2的预防策略，以防止病毒摄取、DNA或RNA复制和细胞因子表达为主题，这可能是突破SAE临床治疗瓶颈的重要途径。