辐照处理对桦褐孔菌多糖抗疲劳作用的影响

路欣彤，齐 欣，高雪峰 ，崔承弼,,

（1.延边大学农学院，吉林延吉 133000；2.延边大学药学院，吉林延吉 133000；3.延边韩工坊健康制品有限公司，吉林延吉 133000）

疲劳是人体非常复杂的生理状态，随着社会压力的增大，许多人的身体处于一种亚健康的状态[1]。在神经系统疾病中，在多发性硬化症、脑出血以及神经肌肉等疾病中，疲劳患者的患病率会增加[2]。首先，肌肉疲劳是由于乳酸和尿素氮等代谢物的过度产生和积累导致的[3]；其次，肌肉或其他相关器官（如肝脏）中活性氧的产生导致氧化应激和对身体的损害，最终机体在无氧运动状态下，通过糖酵解反应获取能量，此运动下产生乳酸，乳酸含量的增多，导致疲劳状况的发生[4]。一些化学药物和天然草药，如黄芪、蛹虫草和红景天等[5]均已被报道具有抗疲劳作用。因此，有必要对天然抗疲劳的活性物质进行研究与开发[6]。

桦褐孔菌（Inonotus obliquus），属于多孔菌科褐卧孔菌属，是一种药食两用的木腐菌[7]，又名桦树茸、西伯利亚灵芝[8]等，无任何毒副作用，主要产于北纬45°～50°的俄罗斯、吉林长白山、日本北海道等地[9-11]。桦褐孔菌中，多糖是其主要的活性成分[12]。目前，来自于各种植物、动物、微生物的多糖，因纯天然、药理活性强、无毒副作用、易于药物质量控制等优点[13]而受到广泛重视，是一种潜在的保健功能成分。此外，许多研究表明，桦褐孔菌含有200多种活性物质，其含有的多糖、桦褐孔菌素、三萜类化合物等，具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抗疲劳、促进益生菌增殖等功效[14-16]。

桦褐孔菌因外界吸收了化学物质成分而导致其在长期的保存和加工过程中营养成分受到影响，一些有机生物的物质成分也发生变化，所以必须对其进行净化处理[17]。辐照是一种新兴的食品保鲜技术，目的是提高食品安全[18-19]。主要运用在杀菌诱变等方面[20]，60Co产生的γ-射线可以与食品相互作用使其发生生理生化反应或生物效应，可通过这种辐照方式提高食品中活性物质各方面的特性[21]。食品经过辐照处理后，对于微量元素、氨基酸、蛋白质以及糖类损失较少，达到消灭食品或农产品中的微生物，如病毒、细菌等的目的。此外，辐照有助于提高卫生和安全性[22]。陈浙娅等[23]研究辐照对裂褶菌多糖提取、分子量及生物活性的影响，发现在一定剂量范围内，随着辐照剂量的增加，裂褶菌多糖的提取率和纯度有显著增加。因此，本实验在前期研究的基础上将选定最优辐照剂量，选择经60Co-γ射线辐照后的桦褐孔菌与未辐照桦褐孔菌制得多糖，研究其对小鼠的抗疲劳效果，为辐照桦褐孔菌多糖在抗疲劳方面的开发与利用提供理论性参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性昆明种小鼠30只，体重（19±1）g 延边大学动物实验中心（生产许可证号：SCXK（吉）2009-0003）；桦褐孔菌干样 长白山科学研究院提供并于四川省原子能研究院进行辐照处理；乙醇（85%）、浓硫酸（98%） 天津市科密欧化学试剂有限公司；葡萄糖粉剂 广西梧州制药（集团）股份有限公司；MDA、SOD、SUN试剂盒、糖原测试盒、乳酸（LD）测试盒、乳酸脱氢酶 （LDH）测试盒 南京建成生物工程研究所。

60Co-γ辐照源 四川省原子能研究院；DF-35型落地式连续投料粉碎机 温岭市林大机械有限公司；HWS-24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司; ScoutSE-SE202FZH型电子天平 常州奥豪斯仪器有限公司；TG16A-WS型离心机 上海卢湘仪器有限公司；CCA-1111-CE 型旋蒸冷凝器 东京理化器械株式会社；LyoQuest-55实验型冷冻干燥机西班牙Telstar 集团公司；DTC-22B型真空泵 日本ULUACKIKO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桦褐孔菌材料处理 将桦褐孔菌破碎，用40目型粉碎机进行粉碎成桦褐孔菌粉末。将桦褐孔菌粉末送至四川省原子能研究院进行辐照处理，以60Co-γ射线为辐照源，根据前期实验设计辐照剂量分别设为 5、 10、20、30 kGy，每组桦褐孔菌剂量率均为 1 kGy/h，辐射距离 37 cm，平铺厚度3 mm，重铬酸钾剂量计进行剂量追踪，辐照时间分别为 5、10、20、30 h，重复三次。辐照处理后的桦褐孔菌置于冰箱冷藏室内 4 ℃贮存备用。

1.2.2 桦褐孔菌多糖的提取 根据多项研究证实，使用乙醚或乙醇等有机溶液，可以脱去多糖中的脂类，防止多糖降解及含量的减少[24]。利用热水浸提法，取不同辐照剂量（5、10、20、30 kGy）桦褐孔菌菌粉各10 g分别放入四个烧杯中，未辐照的桦褐孔菌菌粉10 g放入一个烧杯中，分别加入85%的乙醇（500 mL）并充分混合，80 ℃水浴2.5 h，冷却达到室温，3500 r/min离心5 min，抽滤取清液后旋蒸，置于平皿中充分冻干，即得粗多糖粉末。

1.2.3 最优辐照剂量的选定

1.2.3.1 葡萄糖标准曲线的测定 称取葡萄糖粉末5 mg，定容至50 mL，配制成0.1 mg/mL的母液，取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖溶液，后在各个烧杯中分别进行如下操作：用蒸馏水填补到1 mL，加苯酚0.6 mL，浓硫酸3.6 mL，混合均匀，100 ℃水浴显色20 min，降至室温并测得490 nm处的OD值，得到葡萄糖的标准曲线。

1.2.3.2 辐照剂量选定 桦褐孔菌经过提取过程获得多糖粉末后，称量辐照后的桦褐孔菌多糖粉末和未辐照粉末各1 mg，分别进行以下操作：使用蒸馏水定容至10 mL，混合试剂后，取1 mL，加入苯酚和浓硫酸，全部混合，高温水浴20 min，降至室温并测得490 nm处的OD值。测定桦褐孔菌多糖含量，确定最佳辐照剂量。

1.2.4 实验动物分组及给药 选取体重（19±1）g的SPF级雄性昆明种小鼠，适应性喂养7 d，按照体重随机分成5组，每组6只，即空白对照组、60Co-γ射线最佳辐照剂量桦褐孔菌多糖低剂量组、中剂量组、高剂量组、未辐照桦褐孔菌多糖高剂量组。三种剂量分别为50、250、500 mg/kg·BW，空白对照组灌胃生理盐水，小鼠灌胃剂量0.1 mL/10 g，实验剂量的确定参考其他研究中的剂量[25]。每天记录体重、粮重、水重，持续灌胃30 d。

1.2.5 小鼠试验前后体重、体重增加量与进食量测定 根据中华人民共和国卫生部颁布的《保健食品检验与评价技术规范》[26]的要求每天记录小鼠的体重、粮重、水重，喂养30 d后根据各组数据进行分析。

1.2.6 小鼠爬杆时间与力竭游泳时间测定 第30 d灌胃1 h后，进行爬杆实验。准备有机棒，将爬杆架放入水深30 cm，水温（26±2）℃水箱中进行实验，使小鼠肌肉处于静力紧张状态，记录从实验开始到小鼠无力支撑从有机棒上掉落的时间[27]。按以上实验方法，第3次跌落时终止实验，累计3次的总时间作为爬杆时间，实验结束后继续饲养。测定完爬杆时间后，休息1 d，将小鼠放入水深约30 cm、水温（26±2） ℃水箱中进行游泳实验，使小鼠一直处于肌肉紧张状态。小鼠力竭的时间判断为头部沉入水中10 s内不返回水面，记录时间[28-29]，实验重复三次。

1.2.7 小鼠肝糖原、肌糖原、全血乳酸含量与乳酸脱氢酶活性的测定 小鼠游泳结束后休息30 min，内眦取静脉血。脱颈处死后解剖取出小鼠肝脏，除去结缔组织。实验操作方法根据试剂盒方法，进行测定肝糖原储备量、肌糖原含量，测定全血乳酸含量[30]，测定血清中乳酸脱氢酶活性[31]。

1.2.8 小鼠血清尿素氮含量、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）测定 取游泳力竭后的立即处死的小鼠骨骼肌细胞，根据试剂盒说明要求制备成骨骼肌细胞匀浆。检测血清尿素氮含量与骨骼肌中 SOD活力、MDA含量。

1.3 统计学分析

本实验使用SPSS 23.0对整理后的实验数据进行统计学分析，计算各组均值与标准偏差，进行显著性差异分析。所得的数据以图表和均值±标准偏差（±SD）的形式表示。P＜0.05表示有显著性差异，P＞0.05表示无显著性差异即无统计学意义。

2 结果与分析

2.1 桦褐孔菌多糖最佳辐照剂量的选定

经测定，标准曲线为y=0.3299x+0.1833（R2=0.986），多糖含量如下表所示，由表1得出，桦褐孔菌经60Co-γ辐照后，随着辐照剂量的增大，多糖含量增加，且20 kGy处理增加最显著（P＜0.05），可能是因为产物中含有酸性物质或含有羧基基团的物质，龚志华[32]通过对茯苓不同辐照剂量处理多糖相对分子量和组分分析表明，茯苓辐照后，水溶性总糖的数均相对分子质量（Mn）、重均相对分子质量（Mw）以及多分散系数（PI）均不同程度地增大；同时，茯苓辐照降解产物的多糖组成分析结果显示：茯苓经1000 kGy辐照剂量处理后，降解产物主要是以酸性多糖为主。辐照剂量过高可能导致多糖分子结构发生改变，从而导致多糖含量下降。当辐照剂量为20 kGy时，桦褐孔菌菌粉中提取出的多糖含量最高，故本实验选取辐照剂量为20 kGy的桦褐孔菌用于后续的动物实验。

表1 不同辐照剂量处理后的多糖含量Table 1 Polysaccharide content after treatment with different irradiation doses

2.2 桦褐孔菌多糖对小鼠基础指标的影响

2.2.1 小鼠实验前后体重、增加量与进食量结果由表2结果可知，30 d灌胃药品并未对小鼠体重有明显影响，且未出现任何异常，各剂量组间动物体重增加量基本一致。其他四组摄食量比空白对照组高，灌胃组进水量相比于空白组较高，且在每天换一次垫料的条件下，与对照组相比，其他组垫料较湿润，小鼠毛发柔顺具有光泽，较活泼，且精力旺盛。结果表明，经灌胃后小鼠摄食量、进水量增加，且毛色更加有光泽。

表2 实验前后小鼠指标结果Table 2 Mouse index results before and after the test

2.2.2 力竭游泳与爬杆时间研究结果 运动时间的长短，直接反映了药物的效果，即抗疲劳效果。给药组随着给药剂量的增加，爬杆时间与力竭游泳时间均有不同程度的增加。

结果如表3所示，与CK相比，辐照桦褐孔菌多糖的中、高剂量组与未辐照组小鼠力竭游泳和爬杆时间均有显著差异（P＜0.05），CK与辐照低剂量组无显著差异（P＞0.05）。由此说明，经桦褐孔菌多糖干预后小鼠游泳与爬杆运动时间均得到提高，其中，未辐照组与辐照高剂量组效果有显著差异（P＜0.05）。曹利丹[33]通过小鼠负重游泳实验结果得出桦褐孔菌多糖能够显著延长小鼠游泳时间。辐照高剂量组显著增加了小鼠游泳和爬杆时间，因此，辐照桦褐孔菌多糖比未辐照桦褐孔菌多糖能更明显地延长小鼠游泳与爬杆时间，且在500 mg / kg·BW（辐照高剂量）灌胃剂量下有效增加小鼠运动的时间。

表3 小鼠力竭游泳与爬杆时间结果Table 3 Mice exhausted swimming and pole climbing time results

2.2.3 小鼠肝糖原、肌糖原含量检测结果 糖原是人体储备能量的一种形式，在体内葡萄糖降低的时候能够分解为葡萄糖供能，同时脂肪及蛋白质在葡萄糖降低的时候也会通过糖异生的途径转化为肝糖原从而提供能量。肌糖原的主要作用也是为机体提供能量。运动时体力衰竭是运动促进了糖原的消耗，为了维持糖原的水平，导致机体中糖原分解速度的加快[34]。

由表4可知，与CK比较，经桦褐孔菌多糖干预后的肌糖原含量均显著升高（P＜0.05），CK与低剂量组对肝糖原含量无显著差异（P＞0.05），这可能是由于辐照低剂量组灌胃剂量少，对肝糖原含量影响较小。高剂量组中肝糖原、肌糖原含量最高，且相同浓度作用下，未辐照组肝糖原、肌糖原含量显著低于辐照组（P＜0.05）。黄铃[35]通过小鼠灌胃桦褐孔菌多糖测定肝糖原含量得出，多糖各剂量组小鼠的肝糖原含量均高于对照组，证实了此实验对抗疲劳效果的有效性，因此辐照桦褐孔菌多糖有能明显增加小鼠肝糖原、肌糖原储备量的作用。

表4 各组小鼠肝糖原、肌糖原含量Table 4 Contents of liver glycogen and muscle glycogen in each group of mice

2.2.4 小鼠全血中乳酸含量检测结果 一般运动时机体会进行无氧呼吸，产生大量乳酸，造成缺氧，使得体内乳酸堆积，所以一般运动后会出现身体酸痛的情况，造成疲劳现象，所以产生乳酸的浓度与疲劳产生程度有很大的关系，且呈正比。

如表5所示，与CK相比，其他组乳酸含量均有所下降，且呈剂量依赖性。辐照桦褐孔菌多糖的低、中、高剂量组与未辐照组小鼠BLA含量均有显著差异（P＜0.05），未辐照高剂量组与辐照高剂量组差异不显著（P＞0.05）。ZHONG等[36]通过小鼠游泳实验，证明了桦褐孔菌多糖能够增加肝糖原含量，降低全血乳酸含量。从而可知，乳酸的产生会使机体产生疲劳现象，辐照桦褐孔菌多糖能够降低小鼠乳酸含量，缓解运动中无氧呼吸造成的乳酸堆积现象。

表5 各组小鼠BLA含量Table 5 BLA content of mice in each group

2.2.5 小鼠血清中乳酸脱氢酶活性检测结果 血清中的乳酸脱氢酶是一种体内能量代谢过程中产生的酶，在内脏等组织中广泛存在。通过检测乳酸脱氢酶的活性，可以有效为医学病理学提供帮助，例如心脑血管病、动脉硬化及肝病等大多数疾病[37]。乳酸含量与清除乳酸的乳酸脱氢酶活性是评价机体疲劳和抗疲劳能力的重要指标。

如表6所示，与CK相比，其他组都增加了乳酸脱氢酶活性，辐照桦褐孔菌多糖的低、中、高剂量组与未辐照组小鼠LDH活性均有显著差异（P＜0.05），未辐照组LDH活性显著低于辐照组（P＜0.05），且辐照组呈浓度依赖性。乳酸脱氢酶能够加速乳酸的代谢，维持机体乳酸平衡，从而减少机体中乳酸产生，减轻疲劳症状。此实验证实辐照高剂量组对增强小鼠运动时LDH活性有显著效果。

表6 各组小鼠血清中LDH活性Table 6 LDH activity in mouse serum of each group

2.2.6 小鼠血清尿素氮含量检测结果 正常情况下，机体尿素的生成与排泄处于平衡状态，机体经过长时间运动时不能获得代谢所得的足够能量，导致蛋白质、氨基酸的分解代谢水平上升，进而使血液中尿素氮含量有所上升[38]。机体的抗疲劳能力在一定程度上体现为减少机体中血清尿素氮含量。

如表7所示，与CK相比，辐照桦褐孔菌多糖的中、高剂量组与未辐照组血清尿素氮含量均有显著差异（P＜0.05），随着灌胃剂量的增加，血清尿素氮含量相应减少。CK组经过长时间运动后血清尿素氮含量迅速上升，辐照高剂量组能够显著降低血清尿素氮含量，且显著低于未辐照高剂量组（P＜0.05）。实验证明经过辐照桦褐孔菌多糖干预能够有效降低血清尿素氮含量，缓解疲劳症状。

表7 各组小鼠血清尿素氮含量Table 7 Urea nitrogen content in mouse serum of each group

2.2.7 小鼠SOD活力、MDA含量检测结果 机体运动时自由基增多，会导致细胞膜的结构与功能下降，产生疲劳，自由基与多不饱和脂肪酸反应形成过氧化脂质，代谢生成丙二醛（MDA）[39]。SOD是体内清除超氧阴离子自由基最重要的酶。

如表8所示，与CK相比，辐照桦褐孔菌多糖的中、高剂量组与未辐照组小鼠骨骼肌细胞中SOD活力、MDA含量均有显著差异（P＜0.05），经过力竭测试后，小鼠骨骼肌中MDA含量上升，辐照高剂量组能够显著降低骨骼肌中MDA含量（P＜0.05），且显著低于未辐照组；辐照高剂量组能够显著增加骨骼肌中SOD活性（P＜0.05），且显著高于未辐照组，说明辐照桦褐孔菌多糖具有清除自由基的作用，从而减少代谢生成MDA，对自由基造成的机体损害具有保护作用。

表8 各组小鼠SOD活力、MDA含量Table 8 SOD activity and MDA content in mouse of each group

3 讨论与结论

疲劳是一种疲惫和缺乏能量的亚健康状态，已经成为影响世界20 %以上人口的严重问题。疲劳常分为中枢疲劳和外周疲劳，外周疲劳是指由于过度训练而使肌肉功能下降从而导致的不良生理状态[40]。据报道，组织糖原的消耗是外周疲劳的一个关键因素[41]。能量资源的持续供应和代谢副产物的消除可以恢复外周疲劳[42]。此外，体内氧化系统和抗氧化系统之间的平衡会被剧烈运动破坏，导致活性氧化物和丙二醛的过量产生。这些过氧化物也会导致身体疲劳[43]。

据报道，力竭性游泳运动会导致一些与疲劳有关的血液生化指标的变化，如乳酸和尿素氮[44]，碳水化合物糖酵解将葡萄糖转化为乳酸。乳酸的过度积累导致肌肉和血液pH下降，并抑制糖酵解相关酶的产生和ATP的合成，导致肌肉疲劳。肝脏和骨骼肌中的糖原水平可以反映疲劳程度，糖原的水平直接决定了身体的运动耐力[45]。

本研究讨论了辐照桦褐孔菌多糖对于小鼠抗疲劳能力的影响，结果表明，在5、10、20、30 kGy辐照剂量中，经过60Co-γ射线辐照处理后的桦褐孔菌菌粉，提取所获得的多糖含量最多的为20 kGy下的辐照剂量。通过给小鼠灌胃辐照桦褐孔菌多糖，测定其对小鼠力竭游泳时间和相关抗疲劳的生化指标的影响，实验表明，辐照桦褐孔菌多糖不会对小鼠的生长及发育造成不良影响，且可有效延长小鼠力竭游泳时长与爬杆时间，提高体内肝糖原和肌糖原的水平，增加LDH、SOD的活性，并有效延缓BLA、SUN及MDA的积累，且经60Co-γ射线辐照处理后的桦褐孔菌多糖作用要优于未辐照组，推测由于辐照后多糖含量增加，纯度有所上升，营养物质得到保留。孙熙浛等[46]探讨了60Co-γ射线辐照处理对红景天乙醇提取物抗氧化及美白作用的影响，得出20 kGy 的60Co-γ射线辐照处理红景天乙醇提取物的抗氧化活性最强，并具有良好的美白功效，提示辐照处理能够提高植物活性。ZHANG等[47]通过游泳测试等相关指标测定发现桦褐孔菌多糖PIO-1不仅具有延缓身体疲劳的巨大潜力，而且改善精神疲劳。

综上所述，经60Co-γ射线辐照处理后的桦褐孔菌多糖具有比未辐照桦褐孔菌多糖更好的抗疲劳活性，说明其能够在一定程度上缓解疲劳症状，发挥其营养价值与保健功效，这为辐照桦褐孔菌多糖在抗疲劳方面的开发与利用提供理论性参考。