陕西4个主栽品种桑叶品质评价

崔梦迪，王 军，陈 丹，黄爱云，康淑芳，关 东，徐怀德

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌 712100）

桑（Morus albaL.）是荨麻目桑科（Moraceae）桑属（Morus），落叶乔木或灌木，广泛种植于热带、亚热带和温带地区[1]。全球桑属植物约30种10个变种，而我国就有15种4个变种，广泛分布在广西、四川、云南、陕西等地区[2]。桑叶约占桑树地上部分产量的64%，是桑树的主要产物，生命力很强，每年可采摘3～6次[3]。然而，传统的桑叶只用来养蚕，利用形式单一，造成了大量桑叶资源的浪费。

桑叶是典型的药食同源资源之一，富含蛋白质、氨基酸、多酚、黄酮、生物碱等多种营养功能成分[4-5]。在我国历史上，桑叶还是优良的中草药，常用于治疗风热感冒，目赤眼花，降低血压和消除肝火等[6]。现代医学研究表明，桑叶还具有降血糖、降血脂、抗菌消炎、抗氧化和抗动脉粥样硬化等功效[7-11]。近年来，桑叶已经被用于制作茶、果汁粉及一些膳食补充剂，或作为辅料应用于食品、医药及保健品等行业。

桑树品种不同、生长地区不同等会影响桑叶及其制品的品质，而对桑叶的营养品质、功能品质比较和分析的研究较少，桑叶资源的开发利用有必要对不同品种桑叶的品质进行综合评价。因此，本文选择陕西省4个主栽桑树品种，分析测定桑叶中主要营养功能成分含量、生物活性及色泽品质，并进行综合评价，为完善桑树种质资源生化成分数据库，筛选优质药食用桑种质资源叶提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

陕桑305、湖桑197、707 均采摘自陕西省周至县西北农林科技大学蚕桑基地；小叶桑 采摘自陕西榆林，采摘时间为2020年10月21～27日，采摘部位为桑树中部枝条第6～15位外观完好无损伤的新鲜叶片；没食子酸、福林酚、芦丁、绿原酸、异槲皮苷、紫云英苷、白藜芦醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、1-脱氧野尻霉素（DNJ）、芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）、18种氨基酸标准品 购于北京索莱宝科技有限公司；其它试剂均购于广东光华科技股份有限公司。

UV-1780紫外分光光度计、LC-2030 PLUS高效液相色谱仪 岛津企业管理（中国）有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；FD5-2.5E冻干机 金西盟（北京）仪器有限公司；KjeltecTM 8400 全自动凯氏定氮仪 瑞典FOSS公司；SHA-BA水浴恒温振荡器 金坛市宏华仪器厂；柯尼卡美能达CM-5色差计 科电贸易（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 样品采摘后迅速带回实验室，取其中一部分进行水分含量的测定，其余的干燥至恒重，干燥方式为真空冷冻干燥，干燥条件为-50 ℃，0.025 MPa，24 h。将干燥后的桑叶样品粉碎，过50目筛，储存至-20 ℃冰箱中备用。

1.2.2 水分含量测定 参照AOAC法[12]测定桑叶中水分含量，将鲜桑叶于105 ℃热风干燥24 h，根据干燥前后桑叶质量的变化计算水分含量。

1.2.3 灰分含量测定 桑叶中灰分含量的测定参照GB/T50094-2016食品中灰分的测定第一法。

1.2.4 粗蛋白含量测定 桑叶中粗蛋白含量的测定参照GB/T50095-2016食品中蛋白质的测定第一法。

1.2.5 粗脂肪含量测定 桑叶中粗脂肪含量的测定参照GB/T50096-2016食品中脂肪的测定第二法。

1.2.6 游离氨基酸含量测定 用OPA柱前衍生反相高效液相色谱-紫外检测法测定桑叶中氨基酸含量[13]。流动相A（pH7.2）:27.6 mmol/L醋酸钠-三乙胺-四氢呋喃（体积比为500:0.11:2.5），流动相B（pH7.2）:80.9 mmol/L醋酸钠-甲醇-乙腈（体积比为1:2:2）；Agilent Hypersil ODS柱（5 μm，4.0 mm×250 mm）；采用梯度洗脱，洗脱程序为：0 min，8%B；17 min，50%B；20.1 min，100%B；24.0 min，0%B；流动相流速为1.0 mL/min；柱温为40 ℃；紫外检测器（VWD）检测波长为338 nm，脯氨酸以262 nm检测；外标法定量。

1.2.7 酚类物质测定

1.2.7.1 多酚提取 桑叶中酚类物质的提取是根据TAO等[14]的方法并稍作修改。将1 g桑叶粉悬浮在100 mL 60%（v/v）乙醇溶液中，于40 ℃水浴中避光搅拌10 h后，离心（4 ℃，10000 r/min）10 min，取上清液，并用0.45 μm尼龙膜过滤。将提取液于-20 ℃下避光保存。

1.2.7.2 总酚含量测定 总酚含量通过福林酚比色法[15]测定，用没食子酸作标准品，结果以没食子酸当量（Gallic acid equivalent，GAE）表示。所得标准曲线回归方程为：y=0.053x+0.0529，R2=0.9995。

1.2.7.3 总黄酮含量测定 总黄酮含量的测定参考WANYO等[16]的方法稍作修改，用芦丁作标准品，结果以芦丁当量（Rutin equivalent，RE）表示。所得标准曲线回归方程为：y=4.9146x+0.0861，R2=0.9995。

1.2.7.4 单体酚含量测定 通过HPLC法测定桑叶中5种主要单体酚含量[17]。色谱柱：InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；色谱条件：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序为0 min，5%B；12.5 min，5%B；25 min，12%B；40 min，30%B ；50 min，45%B；51 min，5%B；60 min，5%B。流速1 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长320 nm。以色谱级单体酚作为标准品，外标法定量。

1.2.8 抗氧化活性测定

1.2.8.1 DPPH自由基清除能力测定 取2.0 mL桑叶多酚提取液于试管中，加入2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，混匀后于室温下避光静置30 min，于517 nm波长处测定吸光度[18]。自由基清除能力（Radical ability, RSA）以DPPH自由基抑制率表示，公式如下：

式中：Ai表示样品吸光度，为2 mL DPPH溶液+2 mL样品溶液的吸光度；Aj表示空白对照吸光度，为2 mL样品溶液+2 mL 60%乙醇的吸光度；Ac表示底色对照吸光度，为2 mL DPPH溶液+2 mL 60%乙醇的吸光度。

1.2.8.2 Fe3+还原能力测定 将10 mmol/L TPTZ溶液，300 mmol/L醋酸钠缓冲液（pH3.6），20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液按照1:10:1的体积比混合，即为鲜FRAP试剂，使用前预热至37 ℃。将0.1 mL桑叶多酚提取液和3 mL FRAP试剂混合，在37 ℃水浴避光8 min后，测量其在593 nm处的吸光度[19]。以Trolox浓度（mmol/L）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：y=9.5567x+0.0636，R2=0.9991。

1.2.9 1-脱氧野尻霉素（DNJ）含量测定

1.2.9.1 DNJ的提取 取0.1 g桑叶粉于10 mL离心管中，加入3 mL 0.05 mol/L盐酸，涡旋15 s，离心（12000 r/min，4 ℃）15 min，收集上清液，重复上述操作2次。合并两次上清液，用0.05 mol/L盐酸稀释至10 mL。

1.2.9.2 DNJ含量的测定 参考KIM等[20]的HPLC法并稍作修改。在5 mL离心管中加入100 μL提取液，100 μL 0.4 mol/L硼酸钾缓冲液（pH8.5）和200 μL 5 mmol/L FMOC-Cl（溶于乙腈中），混匀后于25 ℃水浴20 min后，加入100 μL的1 mol/L甘氨酸溶液终止反应，再加入100 μL的1%醋酸水溶液及400 μL超纯水，用0.45 μm尼龙膜过滤。色谱柱：InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；色谱条件：流动相为乙腈-0.1%乙酸（55:45，v/v）；流速1 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL；检测波长254 nm。色谱级DNJ作为标准品，外标法定量。所得标准曲线回归方程为：y=2930.9x+144.21，R2=0.9995。

1.2.10 总叶绿素含量测定 将0.2 g桑叶粉与50 mL 95%乙醇混合，于室温下避光搅拌24 h。将提取物于4 ℃，8000 r/min离心10 min后，取上清液过滤，定容至100 mL容量瓶。用紫外分光光度计测定桑叶中叶绿素含量，665 nm波长处对应叶绿素a，649 nm波长处对应叶绿素b[21]。计算公式如下，结果表示为mg/g d.m.。

式中：C为叶绿素浓度，mg/L；V为提取液体积，mL；f为稀释倍数；m为样品干重，g；T总为总叶绿素含量，mg/g d.m.。

1.2.11 色泽测定 使用色差仪对CIE颜色参数（L*、a*、b*）进行测定[22]。先用白色和黑色的标准瓦片来校准，然后将样品置于透明的比色皿中进行检测，得到L*、a*、b*的值，并计算饱和度C*，公式如下：

1.2.12 综合评价 TOPSIS法是一种常用的组内综合评价方法，能充分利用原始数据的信息，其结果能精确地反映各决策方案之间的差距，常用于处理多指标决策的排名问题[23]。熵权法是能够自动根据各指标所含信息量的大小确定指标权重的客观赋权法，可以避免主观因素对结果的影响。本研究中采用TOPSIS结合熵权法对不同品种桑叶的品质进行综合评价，具体步骤如下：

建立多目标决策矩阵：式中，X=(Xij)m×n，Xij为第i个方案（m=4，表示4个桑叶品种）的第j个评价指标（n=21，表示21个评价指标）的指标特征量。

计算规一化决策矩阵rij：

将归一化决策矩阵与熵权法得到的相关权重相乘，构造规一化加权矩阵。加权归一化值vij计算如下：

式中，wi表示第j个评价指标的权重

确定正负理想解：

式中，A+、A-分别表示正理想解和负理想解，I与正理想样本有关，J与负理想样本有关。

计算与正负理想解的距离：

式中，dj+和dj-分别表示与正负理想解的距离。计算与理想解的相对接近度，并通过比较Rj值对所有方案进行排名。

式中，Rj表示相对接近度

1.3 数据分析

所有试验结果均表示为3次测定的平均值±标准差，所有物质的含量均为干基（dry matter，d.m.）含量。使用统计软件SPSS 26.0进行Duncan’s差异显著性比较和Pearson相关性分析。使用Origin 8.0进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 不同品种桑叶中水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪含量比较

如表1所示，湖桑197中水分含量最高，达到2.78 kg/kg d.m.，小叶桑中水分含量最低，为1.85 kg/kg d.m.。4个品种桑叶中灰分和粗蛋白含量均存在显著性差异（P＜0.05），湖桑197中灰分含量最高，达到14.18 g/100 g d.m.，而小叶桑中灰分含量最低，仅有10.98 g/100 g d.m.。粗蛋白含量在13.74～21.06 g/100 g d.m.范围内，其中707中粗蛋白含量最高，湖桑197次之，小叶桑中所含粗蛋白最少。桑叶中粗脂肪含量相对较高，质量分数位于13.79～22.30 g/100 g d.m.之间。其中，小叶桑中粗脂肪含量最多，其次是707，陕桑305中粗脂肪含量最少。殷霈瑶等[24]对比了高寒地区引种栽培的12个桑树优良品种桑叶的营养成分含量，发现桑叶中蛋白质含量在27.89%～34.23%之间，脂肪含量在2.37%～4.72%之间，灰分含量在86.65～138.73 g/kg之间，这与本研究中所测得的桑叶中粗蛋白和灰分含量相近，但脂肪含量相对较低，这可能是由于地区及气候差异造成的。

表1 不同品种桑叶中水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪含量比较Table 1 Comparison of water, ash, protein and fat content in different varieties of mulberry leaves

2.2 不同品种桑叶中氨基酸含量比较

4个品种桑叶中均检测出18种蛋白质氨基酸，包括8种必需氨基酸。由表2可知，4个品种桑叶中的这18种氨基酸总量和必需氨基酸总量都具有显著性差异（P＜0.05），氨基酸总量和必需氨基酸总量从高到低依次为小叶桑＞陕桑305＞湖桑197＞707。在检测出的18种氨基酸中，各氨基酸含量大多数在品种间具有显著差异（P＜0.05），谷氨酸含量在4个品种桑叶中均为最高。多项研究表明，氨基酸营养品质的主要表征是指蛋白质含量和氨基酸组成及其之间的平衡状态[25]，氨基酸营养品质的关键决定点是必需氨基酸含量的多少[26]。由此可见，小叶桑中氨基酸营养品质最佳。

表2 不同品种桑叶中氨基酸含量比较Table 2 Comparison of amino acid content in different varieties of mulberry leaves

2.3 不同品种桑叶中酚类物质含量比较

多酚类化合物广泛存在于植物当中，被称为植物次生代谢产物，近年来因其抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、降血糖、抗动脉粥样硬化等多种生物活性而受到越来越多的关注。如表3所示，4个品种桑叶中总酚含量存在显著差异（P＜0.05）。小叶桑中总酚含量最高，达到23.086 mg GAE/g d.m.，而707中总酚含量最低，仅有14.816 mg GAE/g d.m.。小叶桑中总黄酮含量最高为56.549 mg RE/g d.m.，除了小叶桑之外，其余3个品种桑叶中总黄酮含量不存在显著差异（P＞0.05），质量分数均高于36 mg RE/g d.m.。沈维治等[27]测定了7份桑种质资源桑叶中的总酚含量后发现，7份桑种质资源间的桑叶中的总酚含量差异较大，变幅为7.84～17.28 mg/g；张芳等[28]测定了贵州省54个桑品种桑叶中黄酮和多酚含量，结果表明，参试品种桑叶黄酮含量分布在14.77～52.27 mg RE/g d.m.，平均含量为27.80 mg RE/g d.m.，多酚含量在18.15～38.54 mg GAE/g d.m.，平均含量为24.54 mg GAE/g d.m.，且多酚和黄酮在品种间差异较大，这些都与本研究中总酚、总黄酮的含量基本一致。

通过HPLC法对4个品种桑叶中5种单体酚含量进行测定，结果见表3。桑叶中绿原酸含量为0.893～4.855 mg/g d.m.，芦丁含量为0.715～2.221 mg/g d.m.，异槲皮苷含量为1.005～2.089 mg/g d.m.，紫云英苷含量为1.581～2.618 mg/g d.m.，白藜芦醇含量为0.029～0.061 mg/g d.m.。除了紫云英苷之外，小叶桑中所含绿原酸、芦丁、异槲皮苷和白藜芦醇都为最高，而陕桑305中紫云英苷含量最高。除了白藜芦醇之外，707中绿原酸、芦丁、异槲皮苷和紫云英苷含量都最少，而陕桑305中白藜芦醇含量最少。总的来看，所检测到的这5种单体酚中，白藜芦醇含量相对最少。孙莲等[29]测定了新疆药桑叶中绿原酸、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、白藜芦醇和槲皮素这6种单体酚，结果表明，药桑叶中绿原酸的量较高，黄酮类成分中芦丁和异槲皮苷的量较高，紫云英苷和槲皮素的量中等，白藜芦醇的量较少。而本研究所测黄酮类成分中紫云英苷的含量最高，推测可能是由于酚类物质提取方式不同所造成的。

表3 不同品种桑叶中酚类物质含量比较Table 3 Comparison of phenolic content in different varieties of mulberry leaves

2.4 不同品种桑叶体外抗氧化活性比较

不同品种桑叶的抗氧化活性如图1、2所示。图1中，不同品种桑叶的DPPH自由基清除率介于48.83%～54.08%之间，4个品种桑叶的DPPH自由基清除率从高到低依次为湖桑197＞小叶桑＞陕桑305＞707。湖桑197和小叶桑的DPPH自由基清除率不存在显著差异（P＞0.05），陕桑305和707的DPPH自由基清除率也不存在显著差异（P＞0.05）。图2中，桑叶的Fe3+还原能力用Trolox当量表示，不同品种桑叶的Fe3+还原能力介于0.056～0.105 mmolTrolox/g d.m.。4个品种桑叶的Fe3+还原能力从大到小依次为小叶桑＞湖桑197＞陕桑305＞707，其中，陕桑305和湖桑197的Fe3+还原能力没有显著差异（P＞0.05），但都与其余品种之间存在显著差异（P＜0.05）。总的来看，湖桑197和小叶桑的抗氧化活性相对较好，这可能与其所含多酚、黄酮等抗氧化活性成分含量有关。

图1 不同品种桑叶DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging ability(RSA) of different varieties of mulberry leaves

图2 不同品种桑叶Fe3+还原能力Fig.2 Fe3+ reduction ability(FRAP) of different varieties of mulberry leaves

2.5 不同品种桑叶中DNJ含量比较

DNJ（1-脱氧野尻霉素）是桑叶中独有的生物碱，可通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性及对胰岛的保护作用从而达到降血糖、预防及治疗糖尿病的目的[30]。DNJ是桑叶中最主要的降糖活性成分，其降糖效果要优于黄酮和多糖等其它活性成分，DNJ含量的多少通常作为评价桑叶降糖活性的主要指标[31-32]。DNJ含量测定结果如图3所示，不同品种桑叶中DNJ含量具有显著差异（P＜0.05）。4个品种桑叶中DNJ含量介于1.15～1.62 mg/g d.m.，707中DNJ含量最高，湖桑197次之，而陕桑305中DNJ含量最少，与707相差29.01%。因此，707可以作为优质的降血糖类桑种质资源。

图3 不同品种桑叶中DNJ含量比较Fig.3 Comparison of DNJ content in different varieties of mulberry leaves

2.6 不同品种桑叶中总叶绿素含量比较

叶绿素是桑叶中最主要的呈色物质，也是食品中重要的天然着色剂，具有降低胆固醇、抗衰老、抗溃疡、抗肿瘤、抗诱变、抗菌消炎等功效[33]。4个品种桑叶中总叶绿素含量如图4所示：707中总叶绿素含量最高，达到8.82 mg/g d.m.；陕桑305次之，总叶绿素含量为7.09 mg/g d.m.；湖桑197和小叶桑中总叶绿素含量差异不显著（P＞0.05），小叶桑中总叶绿素含量最低，仅有6.07 mg/g d.m.

图4 不同品种桑叶中总叶绿素含量比较Fig.4 Comparison of total chlorophyll content in different varieties of mulberry leaves

2.7 不同品种桑叶色泽比较

如表4所示，4个品种桑叶的亮度值L*，绿度值a*，黄度值b*及色泽饱和度C*都具有显著差异（P＜0.05）。L*介于48.64～52.43，a*介于-7.26～-8.13，b*介于27.02～29.63，C*介于28.21～30.58。其中，湖桑197的亮度值L*最高，绿度值-a*也最高；小叶桑的黄度值b*最高，色泽饱和度C*也最高。造成桑叶色泽品质差异的主要因素除了叶绿素等色素类物质的含量之外，还与叶片自身功能如光合生产能力、对外界环境的适应性、抗逆性等密切相关[34]。

表4 不同品种桑叶色泽参数比较Table 4 Comparison of color parameters of different varieties of mulberry leaves

2.8 不同品种桑叶各理化指标相关性分析

郑莎等[35]对45个不同桑树种质和品种资源叶的13个营养成分进行测定和分析后发现，部分营养成分之间存在显著相关关系；黄金枝等[36]对30份桑叶中部分活性成分进行测定后发现，不同品种间各组份存在较大差异，且不同品种各组分间存在着一定的相关性。

本研究对4个品种桑叶中各个指标的相关性分析结果如表5所示，桑叶的营养品质、功能品质、色泽品质之间存在着一定的相关性。水分与粗蛋白、紫云英苷呈显著正相关（P＜0.05），与总黄酮、绿原酸、白藜芦醇、b*、C*呈显著负相关（P＜0.05）；必需氨基酸与氨基酸总量、总酚、总黄酮、绿原酸、芦丁、异槲皮苷、FRAP、a*、b*、C*呈显著正相关（P＜0.05），与DNJ、叶绿素呈显著负相关（P＜0.05）；总酚与氨基酸总量、总黄酮、绿原酸、芦丁、异槲皮苷、FRAP、L*、b*、C*呈显著正相关（P＜0.05），与DNJ、叶绿素呈显著负相关（P＜0.05）；DNJ与叶绿素呈显著正相关（P＜0.05），与a*呈显著负相关（P＜0.05）；叶绿素与L*呈显著负相关（P＜0.05）等。

表5 不同品种桑叶各理化指标间相关性分析Table 5 Correlation analysis of physical and chemical indexes of different varieties of mulberry leaves

对不同品种桑叶各项理化指标之间的相关性进行分析，可以了解各项品质指标之间的相互关联程度，通过测定部分指标就可以预测与之相关的其它指标的变化趋势，从而可以快速地对桑叶品质进行综合评价。

2.9 不同品种桑叶品质综合评价

本研究采用熵权-TOPSIS法对不同品种桑叶的营养品质、功能品质、色泽品质进行综合评价，结果如表6所示。4个品种桑叶的品质综合得分从高到低依次为小叶桑＞湖桑197＞707＞陕桑305，由此可见，小叶桑更适合作为优质药食用桑叶资源进行开发利用。

表6 基于熵权-TOPSIS法对不同品种桑叶品质的综合评价Table 6 Comprehensive evaluation of mulberry leaf quality of different varieties based on entropy weight-TOPSIS method

3 结论

本研究对陕西省4个主栽品种桑叶中水分、灰分、粗脂肪、粗蛋白、氨基酸、酚类物质、DNJ等一系列营养功能成分、抗氧化活性及色泽品质进行较为全面的测定和比较，发现灰分、粗蛋白、总酚、DNJ等成分含量在不同品种桑叶间具有显著差异（P＜0.05），这与郝静怡等[37]的研究结果相一致。陕桑305中紫云英苷含量最高；湖桑197中水分、灰分含量，DPPH自由基清除能力，亮度值L*、绿度值a*都为最高；707中粗蛋白、DNJ、总叶绿素含量最高；小叶桑中必需氨基酸含量、氨基酸总量、粗脂肪、总酚、总黄酮、绿原酸、芦丁、异槲皮苷、白藜芦醇含量，Fe3+还原能力，黄度值b*、色泽饱和度C*都最高。不同品种桑叶的营养品质、功能品质、色泽品质之间也存在着一定的相关性，必需氨基酸含量与氨基酸总量、总酚、总黄酮、绿原酸、芦丁、异槲皮苷含量、FRAP、a*、b*、C*呈显著正相关（P＜0.05），与DNJ和总叶绿素呈显著负相关（P＜0.05）等。

基于熵权-TOPSIS法筛选出小叶桑作为药食用优质品种，旨在为药食用桑叶资源品质的全方位评价及桑叶各项品质指标间的相互关联程度提供参考，也为优质药食用桑叶资源的筛选和进一步开发利用提供依据。