烟粉虱中甘薯双生病毒(sweepoviruses)半巢式PCR快速检测技术的建立与应用

秦艳红 王爽 田雨婷 乔奇 张德胜 王永江 张振臣

摘要

甘薯双生病毒（sweepoviruses）是侵染甘薯的一类重要病毒，通过烟粉虱以持久方式传播，我国甘薯上至少存在8种甘薯双生病毒。本研究根据我国已报道的8种甘薯双生病毒基因组保守区设计了一组引物，建立了单头烟粉虱中甘薯双生病毒的半巢式PCR快速检测方法。特异性和灵敏性分析结果表明，半巢式PCR具有较高的特异性和灵敏性，以8种不同甘薯双生病毒重组质粒为模板时，该方法能同时检测出8种甘薯双生病毒，且半巢式PCR方法的灵敏性比常规PCR高10～10 000倍。对烟粉虱的检测结果表明，该方法能稳定地从单头烟粉虱中检测出甘薯双生病毒。该方法具有经济、快速，灵敏性、特异性和稳定性均较好等优点。

  关键词

甘薯双生病毒;半巢式PCR;检测

中图分类号：

S435.31

文献标识码：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020524

Development of seminested PCR method for rapid detection of sweepoviruses in Bemisia tabaci

QIN Yanhong，WANG Shuang，TIAN Yuting，QIAO Qi，ZHANG Desheng，

WANG Yongjiang，ZHANG Zhenchen*

（Institute of Plant Protection， Henan Academy of Agricultural Sciences， Henan Key

Laboratory of Crop Pest Control， IPM Key Laboratory in Southern Part of North China

for Ministry of Agricultural and Rural Affairs， Zhengzhou450002， China）

 Abstract

Sweepoviruses are the viruses infecting sweet potato and transmitted by Bemisia tabaci in persistent manner. At least eight viruses had been identified in Chinese sweet potato. Primers were designed based on the conserved regions of genome of eight sweepoviruses from China. The rapid seminested PCR detection technology was established for the detection of sweepoviruses in single whitefly. The seminested PCR had high specificity and sensitivity. With the recombination plasmids of eight sweepoviruses as template， eight viruses could be simultaneously detected. The sensitivity of the seminested PCR was higher than that of conventional PCR by 10 10 000 times. Sweepoviruses could be steadily detected from individual whitefly by using the seminested PCR assay. This assay is of economical， rapid， sensitive， specific and stable for rapid detection of sweepoviruses in B. tabaci.

Key words

sweepoviruses;seminested PCR;detection

甘薯雙生病毒是侵染甘薯的一类重要病毒，近年来在我国甘薯上的危害日趋严重。感染该类病毒的甘薯主要表现出叶片上卷、叶脉变黄，叶片变厚等症状，一般造成的产量损失为26%～63%[1]，在有些品种上甚至造成86%的产量损失[2- 3]。根据国际病毒分类委员会最新的第十次分类报告，甘薯双生病毒包括13个种，我国已报道的有8个种，分别为甘薯曲叶病毒Sweet potato leaf curl virus（SPLCV）、甘薯中国曲叶病毒Sweet potato leaf curl China virus（SPLCCNV）、甘薯加那利曲叶病毒Sweet potato leaf curl Canary virus （SPLCCV）、甘薯乔治亚曲叶病毒Sweet potato leaf curl Georgia virus （SPLCGoV）、甘薯河南曲叶病毒Sweet potato leaf curl Henan virus （SPLCHnV）、甘薯山东曲叶病毒Sweet potato leaf curl Shandong virus （SPLCSdV）、甘薯四川曲叶病毒1 Sweet potato leaf curl Sichuan virus  1 （SPLCSiV1）、甘薯四川曲叶病毒2 Sweet potato leaf curl Sichuan virus  2 （SPLCSiV2）[4- 8]。系统发育分析表明，侵染甘薯的双生病毒各个分离物聚成一簇，与侵染其他植物的双生病毒处于不同的分支，因此甘薯双生病毒被称为sweepoviruses[9]。

目前甘薯双生病毒的检测技术研究主要有：环介导恒温核酸扩增（loop mediated isothermal amplification，LAMP）快速检测甘薯曲叶病毒[10];PCR和滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）方法对我国20多个省市的甘薯双生病毒的检测[11]; 甘薯薯块中甘薯褪绿矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus（SPCSV）和甘薯双生病毒的多重PCR检测[12];甘薯双生病毒的实时荧光定量PCR检测[13]。关于烟粉虱Bemisia tabaci中病毒检测方法的研究有单头烟粉虱中SPCSV的半巢式RTPCR检测方法[14]，单头烟粉虱中番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）、瓜类褪绿黄化病毒Cucurbit chlorotic yellows virus（CCYV）和木尔坦棉花曲叶病毒Cotton leaf curl Multan virus（CLCuMuV）的LAMP检测方法[15 -17]等。目前，对烟粉虱中甘薯双生病毒检测方法的研究还未见报道，因此，本研究拟建立一种快速、灵敏的检测方法，用于检测单头烟粉虱是否携带甘薯双生病毒，为检测田间烟粉虱的带毒率提供技术支撑。

1材料与方法

1.1供试材料

无毒烟粉虱为本实验室饲养，饲养在‘中烟100’烟草上。 将携带甘薯双生病毒的甘薯植株置于养虫笼中，取无毒烟粉虱放入养虫笼中饲养，获得带毒烟粉虱。SPLCV、SPLCCNV、SPLCCV、SPLCGoV、SPLCHnV、SPLCSdV、SPLCSiV1、SPLCSiV2和SPCSV（對照）等重组质粒为本实验室保存。

1.2主要试剂及试剂盒

DNA胶回收试剂盒和柱式质粒小量抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司;2×Premix Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、pMD19T载体和DL2000 Marker购自宝生物工程（大连）有限公司;大肠杆菌TG1感受态细胞为本实验室制备并保存于 70℃冰箱;其他常用生化试剂为进口或国产分析纯。

1.3引物设计与合成

根据GenBank公布的甘薯双生病毒保守序列，设计3条引物sweepoviruses380F： 5′TATGGGGGGAGACCGGTAAGACGGAG3′，sweepoviruses1280R：5′GACTGGTATTTTGGAACGCC TTAAATGGC3′，sweepoviruses450F： 5′GTCCCAATTGCTGCCCGAAGCTATGTC3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。sweepoviruses380F和sweepoviruses1280R为半巢式PCR第1轮扩增引物，sweepoviruses450F和sweepoviruses1280R为半巢式PCR第2轮扩增引物。第1轮和第2轮PCR预期扩增片段长度分别为915 bp和846 bp。

1.4半巢式PCR的通用性和特异性检测

将SPLCV、SPLCCNV、SPLCCV、SPLCGoV、 SPLCHnV、SPLCSdV、SPLCSiV1、SPLCSiV2等8种甘薯双生病毒和SPCSV重组质粒分别稀释1 000倍，以稀释的质粒为模板，进行第1轮PCR扩增，反应体系为：2×Premix Taq DNA聚合酶10 μL，稀释的重组质粒0.5 μL， sweepoviruses380F（10 μmol/L）和sweepoviruses1280R（10 μmol/L）各0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环;72 ℃延伸10 min。

以第1轮PCR反应产物为模板，进行第2轮PCR扩增，反应体系为： 2×Premix Taq DNA聚合酶10 μL，sweepoviruses450F（10 μmol/L）和sweepovirus1280R（10 μmol/L）各0.5 μL，第1轮反应产物0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。 反应条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30个循环;72 ℃延伸10 min。确定该方法对8种甘薯双生病毒检测的通用性和特异性。

1.5半巢式PCR方法的灵敏度检测

利用超微量核酸蛋白测定仪测定8种甘薯双生病毒重组质粒的浓度，根据阿伏伽德罗常数将浓度换算为拷贝数[18]，将质粒用超纯水梯度稀释成10 1～10 10，分别以稀释后的质粒为模板，按照1.4中的体系和反应条件进行PCR和半巢式PCR灵敏性的检测，比较两种方法之间的灵敏性差异。

1.6单头烟粉虱中甘薯双生病毒的检测

以带毒烟粉虱为材料，无毒烟粉虱为阴性对照，利用牙签将单头烟粉虱在PCR管中捣碎，加入10 μL ddH2O，12 000 r/min离心1 min，取上清作为模板，分别利用常规PCR和上述建立的半巢式PCR方法对单头烟粉虱进行检测。

1.7田间样品检测

从田间表现卷叶症状的甘薯植株上采集烟粉虱，利用建立的半巢式PCR对单头烟粉虱进行检测，随机挑选阳性目的条带，割胶纯化并克隆至pMD19T载体上，重组质粒由TaKaRa公司完成序列测定，对测序结果进行BLAST比对分析。

2结果与分析

2.1半巢式PCR的通用性和特异性检测

分別以8种甘薯双生病毒和SPCSV重组质粒的1 000倍稀释液为模板，在相同条件下进行半巢式PCR反应，对半巢式PCR的通用性和特异性进

行检测。结果表明，以8种甘薯双生病毒重组质粒为模板的样品均能扩增出846 bp的目的条带，而以

SPCSV重组质粒为模板的 样品未扩增出相应目的条带（图1），表明建立的方法能同时对8种甘薯双生病毒进行检测，通用性和特异性均较好。

2.2半巢式PCR的灵敏度检测

分别以8种甘薯双生病毒重组质粒的10倍梯度稀释液为模板，进行半巢式PCR检测，结果表明（表1），半巢式PCR对SPLCV、SPLCCNV、SPLCCV、SPLCGoV、SPLCHnV、SPLCSdV、 SPLCSiV1、SPLCSiV2 等8种病毒的最低检测浓度分别为4.62、5.17、7.57、 12.00、9.84、6.48、10.90、8.81拷贝/μL，常规PCR对这8种病毒的最低检测浓度分别为4.62×102、5.17×102、 7.57×102、1.2×103、9.84×10、6.48×104、1.09×102、8.81×102拷贝/μL，说明针对不同的甘薯双生病毒，建立的半巢式PCR检测灵敏度比常规PCR高10～104倍，灵敏度较高。

2.3单头烟粉虱中甘薯双生病毒的检测

分别以带毒烟粉虱为材料，无毒烟粉虱为对照进行半巢式PCR扩增，对单头烟粉虱进行24次重复检测结果表明，半巢式PCR能稳定地从单头带毒烟粉虱中扩增出大小为846 bp的目的条带，常规PCR方法仅检测到3次阳性结果，无毒烟粉虱无相应条带，说明该方法稳定性较好（图2）。

2.4田间样品检测

从田间显症甘薯上采集烟粉虱，利用半巢式PCR方法对单头烟粉虱中携带的甘薯双生病毒进行检测，对40头烟粉虱的检测结果表明，常规PCR方法从5头烟粉虱中检测出甘薯双生病毒，检出率仅为12.5%，半巢式PCR从37头烟粉虱中检测到甘薯双生病毒，其中包括常规PCR检测为阳性的5个样品，检出率为92.5%。随机挑选阳性样品的目的条带，克隆测序后进行BLAST比对分析，结果表明，所获得的序列与已报道的SPLCSiV2的Henan742017分离物（GenBank登录号为MK931317）序列一致性达99.04%，说明该方法扩增出的目的片段为甘薯双生病毒的特异性片段，表明该方法可应用于田间样品的检测。

3讨论

甘薯双生病毒是对侵染甘薯的菜豆金色花叶病毒属Begomovirus病毒的总称，为甘薯上发生频率较高的一大类病毒，2006年首次在中国大陆出现[4]，随后逐渐蔓延，目前在我国南方、北方和长江中下游等甘薯主产区均有发生[11， 19]。甘薯双生病毒的传毒介体为烟粉虱，以持久方式进行传播，由于烟粉虱个体小，繁殖能力强，扩散迅速，生产上难以根除，已成为引起甘薯双生病毒快速扩散和流行的重要原因。许多植物双生病毒的流行和暴发与烟粉虱的带毒率和种群数量密切相关[20 -21]，由于烟粉虱在植物病毒的传播和流行中起到关键作用，要明确田间烟粉虱的带毒率，进而明确烟粉虱种群动态对甘薯双生病毒发生流行的影响，需要对大量单头烟粉虱携带甘薯双生病毒的情况进行检测。因此，建立针对烟粉虱中甘薯双生病毒快速、准确的检测方法尤为重要。本研究建立了一种用于检测单头烟粉虱中甘薯双生病毒的半巢式PCR快速检测方法，该方法可对我国现存的8种甘薯双生病毒进行检测，与常规PCR检测方法相比，该方法不用提取烟粉虱的DNA，大大降低了检测成本，节省了时间，且灵敏度高于普通PCR，结果稳定可靠。与之前建立的烟粉虱中其他双生病毒检测方法相比[15， 17]，本研究建立的检测方法具有经济、准确、灵敏度高、特异性好等特点。本研究建立的方法可应用于田间烟粉虱样品的检测，具有较高的应用价值，将为烟粉虱田间带毒率的检测提供技术支撑，对甘薯双生病毒的流行规律和预测预报等研究具有重要意义。

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收稿日期：2020- 10 -09修訂日期：2020- 12 -25

基金项目：

国家甘薯产业技术体系（CARS-10-B13）

* 通信作者

Email：zhangzhenchen@126.com