巨噬细胞来源外泌体成骨作用研究进展

丁银亮 张凡云 孙懿 成杰 赵海燕 王文己

骨骼作为人体的主要物理支架，其完整性可因外伤、肿瘤、感染、畸形等多种原因而受到破坏[1]，骨折不愈合、骨缺损等问题严重影响患者的生活质量。骨的修复和再生是复杂的动态过程，大致可分为炎症期、修复期和重塑期3个阶段，在整个过程中，多种细胞和细胞因子等发生相互作用[2]。骨修复和再生过程中的主要细胞来源是干细胞，该过程中，调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并进一步发育为成熟骨细胞，从而发挥骨生成作用是关键环节。巨噬细胞来源外泌体对骨髓间充质干细胞的成骨分化有至关重要的影响，并对成骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞等相关细胞有一定调控作用。本文回顾相关文献，对现阶段巨噬细胞来源外泌体成骨作用的研究进行综述，为后续探究成骨作用机制和进一步临床应用提供基础。

1 巨噬细胞和外泌体

巨噬细胞是免疫系统的常见效应细胞，根据其来源可分为2类：一类来源于骨髓造血系统，即单核-巨噬细胞系统[3]；另一类来源于胚胎时期扩散到机体不同组织的常驻巨噬细胞（如肝Kupffer细胞、表皮Langerhans细胞和小胶质细胞群等）[4-5]。这2类巨噬细胞在体内多数组织中可见共存状态[6]。近年发现，巨噬细胞在机体发育、稳态平衡、组织修复和再生中也具有重要作用[7]。巨噬细胞对骨折愈合过程有关键影响，其能够调控和招募间充质干细胞，完全参与骨修复和再生过程，巨噬细胞缺乏可导致明显的骨折愈合障碍[8-9]。近年来越来越多的研究表明，相较于细胞因子，巨噬细胞可能更多地通过外泌体靶向作用于间充质干细胞的方式调控成骨活动。

外泌体是一类由多种细胞的质膜或内体膜通过出芽方式形成的30～200 nm的细胞外囊泡，其内部富含核酸、蛋白质、脂质、氨基酸、糖复合物和代谢产物等多种物质[10-11]。研究发现，外泌体在细胞间的通讯中发挥极其重要的作用，亲代细胞释放的外泌体通过配体-受体特异型结合、膜融合或胞吞作用等方式作用于靶细胞，调控其生物学过程[12]。已有研究证实，外泌体与骨相关疾病（如骨质疏松症、骨折和骨关节炎等）之间有着密切联系，其对骨代谢和骨稳态有重要影响[13-14]。近年来，巨噬细胞外泌体已成为继间充质干细胞外泌体后又一个研究热点。

2 巨噬细胞来源外泌体的成骨作用

2.1 不同极化亚型巨噬细胞外泌体的成骨作用

巨噬细胞具有极化特性，在不同的微环境因素刺激下可分化为2个不同亚型：促炎性的M1型巨噬细胞和抗炎性的M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞由脂多糖或辅助性T细胞（Th）1细胞因子如白细胞介素（IL）-10、转化生长因子（TGF）-β等刺激分化而来，可分泌促炎因子IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23、肿瘤坏死因子（TNF）-α等。M2型巨噬细胞由Th2细胞因子如IL-4、IL-13等刺激分化而来，可分泌抗炎因子IL-10 、TGF-β等[15-16]。巨噬细胞主要通过调控和招募间充质干细胞来促进成骨作用，其不同极化亚型释放的外泌体对间充质干细胞的影响有明显差异。

Xiong等[17]研究发现，分别用M1型巨噬细胞外泌体（M1D-Exos）和M2型巨噬细胞外泌体（M2D-Exos）与骨髓间充质干细胞共培养，可见M2D-Exos组细胞的矿物质沉积水平、碱性磷酸酶（ALP）活性和染色程度均明显高于M1D-Exos组细胞，成骨相关基因如胶原蛋白I、ALP、骨钙素（OCN）和Runt相关转录因子2（RUNX2）表达也更高；在小鼠骨折模型体内实验中，M2D-Exos治疗组骨折部位的骨痂体积更大，骨量更多，骨密度和成骨基因表达更高。该研究表明，M2D-Exos较M1D-Exos具有更好的成骨作用。不过，该研究没有设立未极化的M0型巨噬细胞外泌体（M0D-Exos）对照组，无法得知2种极化巨噬细胞亚型与未极化亚型的成骨作用是否存在差异。Kang等[18]的研究则显示，M0D-Exos和M2D-Exos均有明显成骨作用，且两者间无差异，而M1D-Exos相较前两者表现出了成骨抑制作用。张程等[19]研究发现，高糖、高胰岛素条件下小鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力明显下降，而使用M2D-Exos干预则能缓解上述成骨抑制作用，间接证实M2D-Exos具有成骨作用。Li等[20]的研究也得到相似结果，即M2D-Exos具有更明显的成骨作用。

虽然上述多项研究表明M2D-Exos具有更强的成骨作用，但另一些研究却得出不同结论。Wu等[21]研究发现，用M1D-Exos对骨髓间充质干细胞进行培养，与M0D-Exos组和阴性对照组相比，其ALP活性、茜素红染色程度均明显升高，成骨相关基因如ALP、成骨细胞特异性转录因子（OSX）和RUNX2的表达也显著增加。他们认为，M1D-Exos较M0D-Exos的促成骨分化作用更明显。Xia等[22]的研究也得出类似结果。他们发现，与M0D-Exos和M2D-Exos比较，M1D-Exos表现出更明显的成骨作用。

由此可见，不同极化亚型巨噬细胞外泌体之间有明显的成骨作用差异，且在不同研究中同一亚型巨噬细胞外泌体也存在成骨作用差异。Xia等[22]研究认为，这种差异可能来自巨噬细胞来源谱系和细胞培养环境的影响，但其具体原因仍需进一步探究。

2.2 外部因素对巨噬细胞外泌体成骨作用的影响

研究表明，糖尿病能够增加骨折延迟愈合和不愈合的风险[23]。Zhang等[24]研究发现，糖尿病大鼠体内微环境的改变可刺激巨噬细胞发生一定变化，其外泌体较正常巨噬细胞外泌体对骨髓间充质干细胞的成骨能力被明显抑制。体外研究显示，细胞矿化比例下降，成骨相关基因表达明显下调，体内研究也得到相似结果[24]。史亚方等[25]研究发现，牙龈卟啉单胞菌感染巨噬细胞产生的外泌体能够刺激小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞，导致细胞增殖能力下降，促进细胞凋亡，下调成骨相关基因表达，抑制成骨能力。Liu等[26]研究发现，不同浓度的Zn离子刺激对巨噬细胞外泌体的成骨作用有不同影响，ZnCl2溶液浓度为4 μmol/L时，诱导巨噬细胞产生的外泌体促进成骨细胞的成骨作用最强，而浓度为20 μmol/L时，诱导巨噬细胞产生的外泌体促进内皮细胞迁徙能力最强。Zhu等[27]研究发现，Mg离子能够诱导巨噬细胞调节的自噬作用和极化类型，加强巨噬细胞外泌体对骨髓间充质干细胞的成骨作用。Wei等[28]研究发现，骨形态发生蛋白（BMP）-2诱导巨噬细胞产生的外泌体表现出显著的成骨作用。巨噬细胞外泌体的成骨能力受外部因素影响无庸置疑，而对于促进或抑制巨噬细胞外泌体成骨能力的其他影响因素仍需进一步探究，这对于临床应用具有重要指导意义。

2.3 巨噬细胞外泌体在骨组织工程支架中的应用

骨骼的自我修复和再生能力是有限的，通常需要人为干预来促进该过程，为此骨组织工程学应运而生。骨组织工程学通过组织工程支架将细胞或生长因子等植入病损区域，从而促进骨修复和再生[29]。Wei等[28]将BMP-2诱导巨噬细胞产生的外泌体整合到钛纳米管中制备成缓释支架系统。他们发现，该支架系统不仅能增强骨髓间充质干细胞的成骨分化作用，还能调控其自噬作用和细胞因子的分泌。Sun等[30]利用3D打印技术将巨噬细胞经不同浓度β-磷酸三钙(β-TCP)诱导后产生的外泌体分别组建入海藻酸钠和透明质酸基水凝胶支架中，发现该支架系统能促进人脐静脉内皮细胞的增殖、黏附及成血管相关基因表达，其中25 mg/mL的β-TCP诱导后组建的支架系统能够明显增强巨噬细胞抗炎和组织修复细胞募集作用，促进骨髓间充质干细胞的黏附、增殖及成骨分化作用，上调其免疫抑制因子表达。由此可见，巨噬细胞外泌体作为载体植入骨组织工程支架，将是未来骨修复和骨缺损等疾病治疗的另一可能方式，具有良好的临床应用前景。

2.4 巨噬细胞外泌体调控成骨作用的机制

微RNA（miRNA）是一种小分子RNA，其通过靶向结合于目标基因mRNA的方式抑制蛋白质翻译过程，进而调控该基因的表达[31]。大量研究表明，miRNA是调控间充质干细胞成骨作用的关键介质，例如miR-217[32]、miR-291a-3p[33]等表达上调可明显促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，而miR-128-3P[34]、miR-381[35]等表达上调则会抑制其成骨能力。

Kang等[18]研究发现，M1D-Exos和M2D-Exos富含的特异型miRNA有明显不同，这些特异型miRNA在一些成骨相关信号转导通路中发挥重要作用。M1D-Exos富含的特异型miR-155通过作用于BMP信号转导通路，下调BMP2、BMP9、RUNX2等骨诱导相关基因的表达，抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化；而M2D-Exos富含的特异型miR-378a则能够通过上调BMP2和BMP9的表达，促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。Li等[20]研究发现，M2D-Exos富含的miR-690能够作用于骨髓间充质干细胞的胰岛素受体底物-1(IRS-1)/TAZ信号转导通路，上调成骨相关基因RUNX2和OCN的表达水平，发挥成骨作用。Xiong等[17]研究发现，M2D-Exos中富含的miR-5106可被骨髓间充质干细胞摄取，通过作用于盐诱导激酶（SIK）2和SIK3基因靶点，调控相关信号通路，促进成骨分化作用。Zhang等[24]研究发现，糖尿病大鼠模型来源的巨噬细胞外泌体可以通过富含的miR-144-5p与BMP信号转导通路中的Smad1靶基因结合，下调成骨相关基因表达，抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化。

在上述研究中，巨噬细胞外泌体均通过富含的特异型miRNA作用于骨髓间充质干细胞的成骨相关信号转导通路，进而正向或负向调控成骨过程。此外，显而易见的是，巨噬细胞极化类型导致的成骨作用差异也与其富含的miRNA关系密切。Zhu等[27]研究发现，Mg离子诱导巨噬细胞外泌体成骨能力的改变主要是由于miR-381表达下调。Sun等[30]研究发现，β-TCP刺激改变了巨噬细胞外泌体中部分miRNA的表达，进而影响了对人脐静脉内皮细胞、巨噬细胞和骨髓间充质干细胞等的调控作用。上述研究并未涉及具体的调控通路机制，对此仍需进一步探究。

此外，一些研究显示,巨噬细胞外泌体分别通过激活Hedgehog信号通路和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)/BMP-2信号转导通路影响骨髓间充质干细胞的成骨分化[19,21]，但该过程主要受哪些miRNA调控尚未得到验证,巨噬细胞外泌体中富含的蛋白质、脂质、氨基酸、糖复合物和代谢产物等是否参与成骨调控过程，亦需要进一步探究。

3 结语

巨噬细胞来源外泌体具有成骨调控作用，不同的巨噬细胞极化亚型和外界因素刺激均能影响其调控能力，而这种成骨调控作用主要通过外泌体中包含的miRNA等实现，巨噬细胞外泌体也可作为载体在组织工程支架中使用。目前，巨噬细胞来源外泌体的成骨研究正处于迅速发展阶段，对具体调控机制、影响成骨作用的其他因素以及在骨组织工程学中的应用仍需开展进一步探究，为临床应用打下坚实基础。