CRISPR/Cas技术在脊髓损伤修复研究中的应用

魏家宝 林俊卿 郑宪友

脊髓损伤会导致患者损伤平面以下的运动、感觉功能障碍，并伴有排尿和排便障碍、呼吸困难、肠道菌群紊乱等并发症[1-4]。我国每年新增约60 000例脊髓损伤患者[5-6]，而针对脊髓损伤的治疗方法效果不佳，亟需探索新的治疗模式。

基因编辑是一种有潜力的新模式。细菌中成簇存在具有规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）[7]，它们是原核生物抵抗病毒入侵的有效手段。Cas基因编码的Cas蛋白可与CRISPR序列区域发生作用，通 过CRISPRa、CRISPRi、CRISPRoff等 工 具[8-9]与遗传修饰调控因子组合，借助向导RNA实现对靶基因的调控。该类技术具有特异、灵敏、快速、便捷等特点，可广泛应用于基因治疗、分子检测等领域。近年来，学者们发现CRISPR/Cas技术可以调控脊髓损伤的相关基因表达，使其可以作为一种治疗方法用于脊髓损伤修复。同时诸多研究利用CRISPR/Cas技术发现了更多与脊髓损伤相关的基因，为脊髓损伤修复带来新的突破口。本文回顾相关文献，对CRISPR/Cas技术调控脊髓损伤相关基因促进脊髓损伤修复及作为分子检测工具探索脊髓损伤相关未知基因的研究进展进行综述。

1 脊髓损伤与相关基因表达水平的变化

CRISPR/Cas技术通过靶向上调或沉默特定基因，从而改变某些细胞因子、蛋白酶的表达。在研究某一疾病时，可以利用CRISPR/Cas技术针对其诱发、进展及预后过程中发挥关键作用的基因进行靶向调控，从而实现治疗疾病的目的。脊髓损伤的病理生理过程极其复杂，损伤发生后可引起相关基因表达水平变化，而这些变化的关键基因被认为是治疗脊髓损伤的潜在靶点。

脊髓损伤涉及损伤部位组织细胞凋亡、炎症细胞浸润、胶质瘢痕形成、神经血管再生等多个环节，各基因在这一过程中发挥各自的作用。在细胞凋亡方面，脊髓损伤后，与细胞凋亡相关的Bax、Fas基因的表达会上调，通过促进线粒体内细胞色素C释放，破坏DNA，形成死亡信号复合体，降解染色体，从而促使细胞凋亡[10]。而Bcl-2基因的表达上调可阻止细胞色素C释放，抑制凋亡[11]。在炎症细胞浸润方面，脊髓损伤后，与炎症反应相关的单核细胞趋化蛋白（MCP）-1[12]、巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-1α[13]基因的表达迅速上调，激活巨噬细胞释放肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1、IL-6等因子，使炎症细胞在损伤区域聚集，参与继发性脊髓损伤的调控。在胶质瘢痕形成方面，脊髓损伤后，与胶质瘢痕相关的胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）基因表达上调，促进星形胶质细胞的活化增生，封闭损伤区域形成胶质瘢痕，在损伤前期可保护脊髓组织形态，在损伤后期则会抑制轴突生长[14]。在神经血管再生方面，脊髓损伤后，再生基因蛋白（Reg）-2基因的表达迅速上调，促进施万细胞分裂和轴突生长，同时也能促进产生多种神经营养因子，促进神经细胞存活[15]。同时，血管内皮生长因子(VEGF)基因的表达增加，促进血管再生，为脊髓损伤的修复提供良好的微环境[16]。这些在脊髓损伤各环节中表达的基因可以作为CRISPR/Cas技术编辑的象，通过调节其表达来促进脊髓损伤的恢复。

2 CRISPR/Cas技术应用于脊髓损伤治疗的探索

2.1 调控脊髓损伤相关细胞因子

神经组织在其生长分化过程中受到多种细胞因子的调控，包括胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经生长因子(NGF)、结缔组织生长因子（CTGF）等。这些细胞因子在脊髓神经生长分化的各阶段都起到不可忽视的调控作用，利用CRISPR/Cas技术调节这些细胞因子的表达有助于促进脊髓损伤的修复。

GDNF参与脑中多巴胺神经元的生长和维持，对损伤神经元进行保护，同时促进损伤后神经元的再生[17]。Khazaei等[18]利用CRISPR/Cas技术敲除DLK1基因后发现，GDNF能够通过介导DLK1基因来调节Notch信号的表达，以促进星形胶质细胞分化、突触重建，从而达到促进脊髓损伤小鼠运动功能恢复的作用。这表明，利用CRISPR/Cas技术增强GDNF表达能够促进脊髓损伤的恢复。

NGF是一种神经营养蛋白，其可激活伤害性神经元，将疼痛信号从周围传递至中枢神经系统，并通过酪氨酸激酶受体发出信号，从而对神经元产生作用[19]。目前，鼠源NGF（mNGF）已用于治疗各种神经元和非神经元疾病。Gu等[20]利用CRISPR/Cas技术将NGF基因插入小鼠下颌下腺细胞，在小鼠下颌下腺中特异性表达人源NGF（hNGF），发现hNGF在人体细胞中的生物学活性明显高于mNGF，其促进脊髓损伤修复的效果优于mNGF，损伤部位轴突再生水平更高。这表明，可以利用CRISPR/Cas技术通过上调NGF表达来达到治疗脊髓损伤的目的。

BDNF通过与酪氨酸激酶B结合，激活Ras-丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路，增加BDNF基因及BCL-2基因的表达，其可以促进神经生长发育[21]。Hsu等[22]利用CRISPR/Cas技术将BDNF基因插入大鼠脂肪干细胞后，将修饰后的脂肪干细胞植入脊髓损伤部位，发现其能够促进施万细胞迁移，同时促进神经元增殖和神经轴突生长。由此可见，利用CRISPR/Cas技术增强脊髓损伤部位BDNF表达能够达到促进脊髓损伤恢复的目的。

CTGF上调能够促进受损的神经细胞间形成胶质桥接，在细胞分化、组织迁移、肿瘤进展等方面具有重要意义[23]。Klatt等[24]研究发现，通过CRISPR/Cas技术增强CTGF表达后，斑马鱼脊髓损伤修复速度增快，游泳时间延长。这提示通过CRISPR/Cas技术增强CTGF表达有助于促进脊髓损伤的修复。

总而言之，在脊髓损伤的进展和恢复过程中，各环节都受到诸多细胞因子的调控，通过CRISPR/Cas技术来调节这些细胞因子的表达，能够促进脊髓损伤的恢复。

2.2 调控蛋白酶

脊髓损伤后，受损的局部组织会出现氧化应激障碍、胶质瘢痕形成、血管再生等多种病理生理过程，其间许多蛋白酶也发挥着不可忽视的作用，如磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）、吡哆醛激酶（PDXK）、髓磷脂碱性蛋白（MBP）、C3补体等，利用CRISPR/Cas技术调节这些蛋白酶的表达有助于进一步探明脊髓损伤后各环节的进展过程。

PTEN蛋白具有磷酸酯酶的活性，可使磷脂酰肌醇三磷酸去磷酸化，从而抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（AKT）信号通路，抑制肿瘤细胞生长。Moses等[25]研究发现，先天性PTEN基因遗传缺失可导致中枢神经系统轴突再生。该实验研究结果显示，使用CRISPR/Cas技术沉默神经细胞中的PTNE基因，可起到促进神经细胞轴突再生的作用，提示CRISPR/Cas技术可通过调控PTEN基因表达来促进脊髓损伤修复。

PDXK是维生素B6的重要组成部分[26]，能够抑制氧化应激反应，减少血管内皮损伤，维持多种细胞生长发育。Xiong等[27]通过使用CRISPR/Cas技术敲除PDXK的靶标miRNA-339，结果脊髓横断面远端皮质中神经轴突生长显著增加，且皮质神经元细胞凋亡减少。这提示，除了直接编辑脊髓损伤相关DNA外，通过CRISPR/Cas技术敲除靶标RNA也是促进脊髓损伤恢复的一种方法。

MBP是一种髓鞘相关蛋白，具有丝氨酸蛋白酶活性。MBP通过切割细胞外蛋白L1细胞黏附分子，增强成年哺乳动物神经元生长。MBP对神经祖细胞轴突生长的刺激作用是通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ基因的表达而实现的。一些学者使用CRISPR/Cas技术敲除MBP基因，发现MBP通过MBP/L1cam/PPARγ信号通路促进轴突再生，这也进一步提示CRISPR/Cas技术可通过增加MBP基因表达来促进脊髓损伤的恢复[28-29]。

C3是血清中含量最高的补体成分，主要由巨噬细胞和肝脏合成，具有酶活性，在炎症反应中发挥重要作用。Guo等[30]研究发现，通过CRISPR/as技术敲除C3相关基因能够激活星形胶质细胞，上调TNF-α的表达，使C3缺陷小鼠的神经纤维再生得到改善。这表明，补体抑制也可能是促进中枢神经系统再生的潜在靶向疗法。

脊髓损伤进展和恢复过程中有诸多蛋白酶发挥着不可或缺的作用，通过CRISPR/Cas技术编辑基因来调节这些蛋白酶的水平，有望成为治疗脊髓损伤的有效方法。

3 基于CRISPR/Cas技术的分子检测在脊髓损伤领域的探索

随着脊髓损伤相关研究不断深入，研究人员需要筛查参与脊髓损伤病理生理学改变的大量未知基因，分子检测工具是一种可用方法。常规分子检测工具主要包括聚合酶链式反应、分子杂交技术以及基因芯片技术，这些技术操作复杂、花费昂贵，因此需要开发一种更快捷、更廉价、更灵敏的检测技术。

CRISPR/Cas技术具有精准识别和切割核酸片段的能力，使其可用于分子检测。CRISPR/Cas检测平台灵敏度高、速度快、无需大型设备，相较于传统分子检测方式有明显优势。除了Cas9，Cas家族还有许多具有切割活性的蛋白。Cas13a能在CRISPR RNA（crRNA）引导下切割靶标RNA，之后仍能保持活性，进而切割其他RNA[31]；Cas12a也具有类似性质，其能够切割特异的靶标单链DNA[32]。此外，有学者开发出基于Cas14a的检测平台，相较于Cas12a，其与靶标结合的特异性更强，可用于需要单碱基分辨的检测[33]。

基于这些检测平台， CRISPR/Cas技术可用于脊髓损伤等多个领域的分子诊断和筛查。Klatt Shaw等[34]以CRISPR双链引导核糖核蛋白（dgRNP）诱变斑马鱼基因，通过28个dgRNP筛选出17个靶向基因，这些基因的诱变体在脊髓损伤后未能恢复游泳功能。此外，Keatinge等[35]使用CRISPR/Cas技术将合成CRISPR RNA（sCrRNA）注射入脊髓损伤部位，通过约350种sCrRNA靶向30个潜在的巨噬细胞相关基因后，筛查出4个影响轴突再生的基因（tgfb1a、tgfb3、tnfa、sparc），这4种突变体的轴突再生受到明显抑制。这提示，可通过CRISPR/Cas技术增强这4种基因的表达来促进脊髓损伤的修复。Sox2是Sox转录因子家族成员之一，通过高迁移率族蛋白介导，在早期胚胎发育阶段对干细胞干性维持和神经组织细胞增殖有重要作用，在生长发育后期其表达则会受到限制[36]。Tazaki等[37]通过研究蝾螈筛查得到脊髓生长发育的关键基因Sox2，蝾螈是唯一能在功能上再生肢体和脊髓所有细胞类型的四足动物，通过CRISPR/Cas介导的基因编辑，敲除蝾螈细胞中Sox2基因，蝾螈的脊髓生长发育出现异常，且再生功能消失。这表明可以通过CRISPR/Cas技术增强Sox2基因的表达来促进脊髓损伤的修复。

随着基于CRISPR/Cas的分子检测技术不断进步，研究人员能够更便捷、更高效地发现脊髓损伤某一病理过程中发挥作用的关键基因，进而开发新治疗方案来促进脊髓损伤的恢复。通过CRISPR/Cas技术进行分子检测能大大加快脊髓损伤领域的科研进展。

4 结语

脊髓损伤具有高发病率、高致残率、高耗费及低龄化的特点，并产生很多并发症，目前临床上仅能采用常规的药物治疗和针对并发症的辅助治疗。CRISPR/Cas技术给治疗脊髓损伤带来新希望。通过CRISPR/Cas技术对在脊髓损伤过程中发挥重要作用的细胞因子、蛋白酶的相关基因进行编辑，达到了促进脊髓损伤恢复的效果。虽然在使用中也面临着脱靶和遗传毒性[38]的问题，但是随着Cas9TX[39]、SuperFi-Cas9[40]等更先进的蛋白酶被开发，脱靶率显著降低，CRISPR/Cas技术的安全性也大大提高。同时，基于CRISPR/Cas的分子检测技术不断发展，能不断发现新的治疗靶点，加速脊髓损伤领域的研究进展。